쥐 일차 간세포 구상체 혼합 배양

이두훈, 박정극

동국대학교 화학공학과

Spheroid Co-culture of Rat Primary Hepatocytes

Doo-Hoon Lee and Jung-Keug Park

Department of Chemical Engineering, Dongguk University, Seoul, Korea

서 론

최근의 의학 발달에도 불구하고 전격성 간손상(fulminant hepatic failure, FHF) 환자의 경우 치사율이 90%에 이르고 있으며 이러한 경우의 생존율을 높이기 위하여 간조직과 간세포를 이용하여 hollow fiber module등 체외의 간 보조장치로서 생물학적 반응기 시스템(1)을 응용하기에 이르렀다. 인공간(bioartificial liver)의 개발을 위해서는 간세포를 간의 특이 기능 활성이 우수한 상태로 장기간 배양하는 기술이 필수적으로 선행되어야 한다. 일반적인 배양조건에서 간세포는 매우 짧은 시간 안에 간기능을 상실하며 빠른 속도로 괴사한다. 간의 체내 구조로 볼 때 간세포는 세포외 기질뿐만 아니라 다른 간세포 및 다른 종류의 세포와도 직접 접하고 있으므로 간기능의 활성은 동종세포 및 이종세포 상호작용 모두에 의하여 영향을 받고 있는 것이다. 따라서 간세포가 체외 배양에서 높은 간기능 활성을 유지한 채로 장기간 배양되려면 체내의 구조와 되도록 가깝게 재구성하는 것이 필요한데 이를 만족시킬 수 있는 방법이 혼합배양이다.

간세포의 단층배양보다는 세포가 구 형태로 3차원적인 집합체를 이루도록하는 구상체 배양이 간세포 및 조직의 morphology와 생존력, 간기능 면과 scale-up 측면의 우수함이 국외연구현황(2)뿐 아니라 본 실험실(3)에서도 그동안의 연구를 통하여 증명되었음에도 불구하고 구상체 배양에 대한 혼합배양의 영향에 대한 연구는 전술한 어려움으로 인하여 국내 뿐만 아니라 국외에서도 거의 전무한 실정이다. 간세포 배양 기술의 최종 단계로 여겨지는 혼합배양을 이용한 간세포 구상체 배양은 체내의 간조직 구조와 가장 유사하게 간 조직을 재구성하는 방법이라는 것에는 이견이 없을 것이다.

본 연구에서는 최적화된 간세포 응집 시간(4)과 알지네이트 고정화 방법을 이용하여 구상체 혼합배양을 실시하였다. 간세포 접종 후 다양한 시간 간격으로 비실질세포를 접종하고 다양한 방법으로 간세포와 비실질세포의 응집과정을 관찰하였으며 적당한 크기의 응집체가 형성되었을 때 고정화하여 배양하였다. 조직 분석 결과 쥐 endothelial cell line이 간세포와 잘 응집되어 in vivo 형태의 cell plate 구조를 형성하는 것을 관찰할 수 있었으며 간기능 활성 또한 우수하였다.

실험 재료 및 방법

간세포의 분리는 Seglen-method(5)에 기초를 두고 변형된 방법을 실행하는데, 이는 in situ 상태에서 collagenase로 간의 기질을 분해하여 간세포를 얻는 기술로서, 2단계로 시행하는데 그 방법은 다음과 같다. 180-200 g 체중의 Sprague-Dawley rat을 사용하였으며 trypan blue staining 방법에 의하여 세포 수를 측정하였다.  보통 200 g의 쥐로부터 약 2-3 × 108 개 정도의 간세포를 회수할 수 있으며 viability는 90% 이상이다.

배양 배지로는 William's E Medium에 Epidermal growth factor(20□g/l), Insulin (10mg/l), Hydrocortison(3.4□M), CuSO4·5H2O(0.1□M), ZnSO4·7H2O(50pM), H2SeO3(3□g/l), Linoleic acid(50mg/l), NaHCO3(1.05g/l), HEPES(1.19g/l), Penicillin(0.0588g/l), Streptomycin (0.100g/l)을 첨가하여 사용하였다.

혼합배양에는 인체 피부 섬유아세포(H-fib), 정상간에서 유래한 쥐 간의 epithelial cell line (RLEC, ATCC CCL1439 Clone 9, Passage 16) 및 rat prostate endothelial cell line (RPEn, ATCC CRL-2222, YPEN-1)을 사용하였다.

구상체 혼합배양 조건을 검색하기 위해서는 많은 가지수의 실험을 동시에 실시할 필요가 있다. Orbital shaker를 이용하여 6 well plate를 교반하여 부유배양을 실시하였다. Well plate는 silicon 용액(Sigmacote, Sigma Co.)으로 두 번 코팅하여 세포가 부착하지 못하도록 하였으며 코팅용액은 여과 멸균하여 사용하였고 코팅후 건조한고 PBS로 세척하여 사용하였다.

2×배지로 희석한 1% 알지네이트 용액을 간세포 구상체와 2×106cells/mL농도로 혼합하여 1mL를 주사기(바늘직경 23G, 용량 5ml)에 넣는다. 펌프로 공기를 불어주면서 교반시키는 100mM CaCl2용액에 떨어뜨려 bead를 형성시킨다. 30초 후 채로 걸려서 6-well 배양 용기에 절반씩 나눠 넣고 배지는 well당 2mL씩 넣어 orbital shaker위에서 배양한다. Bead의 크기는 대략 1000∼1500□m정도이다.

혼합배양 구상체의 내부 구조를 관찰하기 위하여 HE staining을 통하여 확인하였다. 좀더 얇게 구상체를 자르기 위해 TEM을 위한 고정화 방법을 추가로 사용하였다. Glutaraldehyde 2.5%용으로 고정한 후 위와 같은 동일한 탈수 과정을 거친후 epoxy resin을 이용하여 embedding하였으며 구상체는 toluidin blue로 염색하여 관찰하였다.

배양된 간세포 구상체의 detoxification능력을 조사하기 위하여 암모니아의 분해속도를 아산제약의 indophenol kits를 사용해서 측정하였고 이에 따른 urea 생성농도는 Blood urea nitrogen assay kit(Sigma Co.)를 사용하여 측정하였다. 암모니아의 제거 속도를 측정하기 위하여 배양 3일째 부터 1mM NH4Cl을 첨가한 배지를 사용하였다. 간세포의 중요한 대사기능의 하나인 알부민의 합성 및 분비는 ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) 법을 사용하였는데, 1차항체(IgG fraction to rat albumin), 알부민 표준, 2차항체(Peroxidase-Conjugated IgG fraction to rat albumin)는 OGARNON TECHNIKA CORPORATION 시약을 사용하였으며, 1차항체는 2□/□를 2차항체는 1/5000을 사용하였다.

결과 및 토의

간세포와 비실질세포의 부착 확인

간세포를 well당 1×106개를 접종한 후 RPEn, RLEC, H-fib를 각각 2, 6, 12시간 후에 well당 4×105개씩 접종하였다. Plating 방법은 간세포 구상체를 콜라젠이 코팅된 표면에 접종하고 정치하여 표면에 spreading시키는 방법이다. 간세포와 비실질세포는 배양 표면에서는 확연히 구별되므로 비실질세포의 존재여부를 확인할 수 있다. 다양한 간격을 두고 비실질세포를 접종하고 총 19시간 동안 부유 배양된 간세포 구상체를 plating한 후 2일이 경과한 후에 관찰한 결과 간세포만 접종한 경우 다른 세포는 관찰되지 않았으며 RPEn의 경우 2시간과 6시간 간격을 두고 접종한 경우에 간세포 주변에서 많이 관찰되는 것으로 볼 때 가장 잘 섞이는 것으로 판단된다. RLEC와 H-fib의 경우는 매우 적은 양의 세포만이 간세포 주변에서 관찰되어 간세포와 잘 부착되지 않는 것으로 판단되었다.

혼합배양 구상체의 내부 구조

광학현미경으로는 혼합 구상체의 내부를 관찰할 수 없기 때문에 hematoxylin-eosin(HE) 염색과 toluidin blue 염색을 통하여 조직학적 형태를 관찰하였다. Figure 1은 HE 염색 사진이다. Plating 방법으로 확인한 바와 같이 RPEn을 혼합배양한 경우를 보면 구상체 표면에 RPEn이 분포함을 알 수 있다. RLEC와 H-fib와의 혼합 구상체는 내부나 외부에서 비실질세포를 찾을 수는 없었다. 다만 순순한 간세포 구상체와는 내부 형내가 조금 다른 것으로 보아 비실질세포의 영향이 있었던 것으로 판단된다.

a

b                        c                       d

Figure 1. Histology of cocultured hepatocyte aggregates. The aggregates were cultured for 14 days. After initial hepatocyte seeding, nonparenchymal cells were inoculated with 2 hours intervals. Arrow in (b) indicates RPEn layer. Bar indicates 40□.

(a) Pure hepatocyte spheroids, (b) RPEn coculture, (c) RLEC coculture, (d) H-fib coculture

혼합배양된 구상체의 간기능 활성

간세포를 well당 1×106개를 접종한 후 RPEn, RLEC, H-fib를 각각 2, 6, 12시간 후에 well당 4×105개씩 접종하여 형성시킨 혼합 구상체의 알부민 분비 능력을 Figure 2에 나타내었다. 혼합배양된 구상체의 알부민 분비율을 보면 대부분 순수 간세포 구상체 보다 낮은 수준을 보인 반면 RPEn(2hours interval) 혼합 구상체의 경우 알부민의 분비율이 상당히 높은 수준으로 오래 유지되었다. 접종 간격에 따라 알부민의 분비율에 많은 차이가 발생하였다. 이는 접종 간격에 따라 비실질세포가 간세포에 부착되는 정도와 위치가 변하기 때문으로 생각된다.

간세포 분리과정에서 섞여 들어가는 소량의 간의 비실질세포가 간세포 구상체에서 관찰되기는 하였지만 본 연구에서 처럼 의도적으로 비실질세포를 첨가하여 혼합 구상체를 형성시킴으로서 구상체의 간기능을 증대시킨 경우는 국내는 물론 아직 해외에도 보고된 바가 거의 없으며 체외에서 조직을 형성시키는 연구에 매우 중요한 현상으로 사료된다.

본 연구에서 얻어진 혼합배양을 이용한 간세포 구상체 배양 기술은 그 동안 연구 개발되었던 세포외 기질의 사용이나 다양한 반응기 형식 등 다른 모든 시스템에 적용하여 성능을 개선할 수 있기 때문에 그 파급 효과가 매우 클 것으로 사료된다.

Figure 2. Albumin secretion rates of cocultured hepatocyte spheroids.

참고 문헌

1. Jacek Rozga, Achilles A. Demetriou, et.al.,"Isolated Hepatocytes in a

Bioartificial Liver: A Single Group View and Experience", Biotechnology

and Bioengineering, Vol. 43, 645-653, 1994.

2. A.P.Li, Dale J.Beck,"A Simplified Method for the Culturing of Primary

Adult Rat and Human Hepatocytes as Multicellular Spheroids", In Vitro

Cell.Dev.Biol., 28A: 673-677, 1992

3. 이두훈, 류재남, 양은경, 정미경, 박순희, 박정극, □교반 용기를 이용한 쥐 일차

간세포의 구상체 배양□, 한국생물공학회지, 12(4), 449-455, 1997.

4. S. M. Yang, D. H. Lee, J. K. Park, "Effects of Degree of Cell-Cell Contact

on Liver Specific Functions of Rat Primary Hepatocyte", Biotechnology and

Bioprocess Engineering, 5(2), 99-105, 2000

5. Seglen P.O.,"Preparation of Isolated Rat Liver Cells", Meth. Cell. Biol., Vol.

13, 29-83, 1975