이차 대사산물의 동정 및 구조분석

강  삼  식

서울대학교 천연물과학연구소

Identification and Structure Determination of Secondary Metabolites

Sam Sik Kang

Natural Products Research Institute, Seoul National University

지구상에는 250,000∼500,000의 식물이 분포하고 있는 것으로 알려져 있으며, 이들 식물의 대사산물 가운데 대부분을 차지하고 있는 2차 대사산물은 매우 다양하다. 이들 식물 가운데 단지 극히 일부만이 식물화학적으로 연구되었을 뿐이다. 이들 이차 대사산물이 새로운 선도화합물이 되기 위해서는 생물학, 생약학, 약리학, 화학, 독성학 등의 분야가 서로 학제간 연구가 요구되며 일반적으로 다음과 같은 과정을 거치고 있다[1].

즉	1. 대상식물의 선정, 채집, 식물학적 감정 및 추출을 위한 식물의 조제

2. 용매를 이용한 추출 및 예비실험

3. 조 엑스에 대한 생물학적 및 약리학적 활성검색

4. 순수 활성물질을 얻기 위한 chromatography

5. 구조결정

6. 화합물에 대한 분석학적 및 약리학적 규격설정

7. 독성실험

8. 부분 또는 전합성

9. 구조-활성관계 구명을 위한 유도체의 합성

이런 일련의 과정 중에서 가장 핵심적인 순수 화합물에 대한 구조결정은 과거에는 주로 화학적 방법에 의해 다량의 화합물이 요구되었으나, 최근에는 분석기기의 발전 및 구조결정법의 현저한 진보는 미량의 물질만으로 가능하게 하였다.

그러나 천연에서 얻은 물질의 구조를 결정하는데는 우선 그 물질이 얻어진 식물(생물)과 분류학적으로 가까운 것으로부터 어떠한 화합물들이 얻어지고 있는가를 조사할 필요가 있다. 같은 과(科) 같은 속(屬)의 식물(생물)에서는 빈번하게 동일한 또는 유사한 화합물이 얻어지는 것이 알려져 있기 때문이다. 또한 이 화합물이 순수 분리된 과정에서 얻어질 수 있는 각종 data 즉, 용해도, 산성, 중성 또는 alkali성인지의 여부, chromatography상에서의 특징이나 정색반응 등도 이 화합물이 어떤 기본골격, 또는 어떤 계통의 화합물에 속하는가를 추정하는데 많은 도움을 받을 수가 있다.

다음에 이 화합물의 UV, IR, NMR, MS 등의 spectrum을 측정하여 이들을 해석하고 종합하면 이 물질이 어떤 계통의 골격을 가진 화합물인가를 알 수가 있다.

분리된 화합물이 이미 알려진 화합물로 밝혀졌다면 표준품과 직접적인 혼융시험, 각종 spectrum 및 선광도 등의 물리화학적 정수를 직접 또는 문헌치와 비교하여 이를 확인한다.

문헌에 기재되지 않은 신물질의 경우에는 본래 분리된 그대로의 화합물과, 이 화합물에 대한 각종 유도체들을 합성한 후 이들의 각종 spectrum을 검토하고 화학적 반응 등을 행하여 구조를 결정해야 한다. 이때 이 물질이 어떤 화합물군에 속하는가를 결정하는 것이 매우 중요하며, 이것이 추정되었다면 이 화합물군들의 구조결정에 대한 최근의 문헌을 충분히 조사하여 참고로 하는 것이 요구되고 있다. 이런 구조의 추정 과정에는 생합성적인 고찰도 매우 유익한 정보를 제공하고 있다.

현재 보편적으로 이용되고 있는 구조결정법에 대하여 간략히 소개하면 다음과 같다. 최종적으로 얻어진 순수물질에 대해서는 우선 융점과 선광도를 측정해야한다. 또한 정확한 분자식을 얻기 위해 원소분석을 행하거나 고분해능질량분석을 실시하여 분자식을 구하고 이로부터 이 물질의 불포화도를 계산한다. UV spectrum은 일반적으로 구조결정에는 많은 data를 제공하지 않으나 특정 발색단(chromophore)의 확인이나 특정 화합물군에 따라서는 절대적인 data를 제공하기도 한다. 특히 식물색소 즉 flavonoid 등의 화합물군이나, phenol성 물질 등은 UV data가 구조결정에 매우 유용한 정보를 제공하고 있다. IR spectrum은 functional group region (3500∼1300cm-1)에서 나타나는 흡수band를 해석하여 관능기의 존재를 예측할 수 있다. 그러나 지문영역(finger print region, 1300∼909cm-1)에서의 흡수band는 일반적으로 대단히 복잡하여 미지물질의 구조결정에는 큰 도움이 되지 않으나 기지물질의 확인에는 절대적이다. NMR spectrum은 현재 구조결정에 가장 강력한 수단이 되고 있다. 일반적으로 화합물군에 따라 주로 사용되고 있는 용매가 있으므로 측정한 data를 서로 비교하기 위해서는 가급적 같은 용매를 사용하여 측정하는 것이 좋다. 특히 최근에는 기본적으로 얻을 수 있는 chemical shift나 coupling constant (J) 이외에 새로운 2D spectroscopy법이 많이 개발되고 이들로부터 얻은 data를 이용하면 구조결정에 많은 도움을 받을 수 있다. 예를 들면 1H-1H COSY (correlation spectroscopy), 1H-13C COSY, HMQC (heteronuclear multi-quantum correlation), HMBC (heteronuclear multiple bond connectivity), TOCSY (total correlation spectroscopy) 등을 이용하여 구조결정을 하게 되므로서 이 분야에서 한 단계 도약하는 계기를 마련하였다고 사료된다.  또 하나의 획기적인 발전을 이룩한 분야는 mass spectrometry 분야라고 생각된다. Mass spectrum을 측정하여 분리한 물질의 분자량을 알 수 있으며, 이로부터 생성되는 fragment ion들을 확인함으로서 화학구조를 추정할 수 있다. 그러나 천연에서 얻어지는 화합물들의 상당수는 불안정한 화합물도 존재하며, 때로는 매우 극성이 강한 glycoside 형태로도 존재하기도 한다. 이 경우에는 기존의 전자충격(electron impact) 법에 의한 이온화 방법으로는 분자량을 측정할 수가 없다. 이런 경우에는 소위 soft ionization법으로 알려진 FAB (fast atom bombardment)-MS나 electrospray ionization MS, 또는 APCI (atmosphere pressure chemical ionization)-MS 등의 방법을 사용하면 가능하므로 최근에는 이런 방법을 많이 사용하고 있다. 특히 이런 soft ionization법에서는 극성이 매우 강한 고분자화합물의 분자량 측정도 가능하고, 고분해능질량분석이 가능하므로 이로부터 얻어진 MS data만 가지고 분자이온의 분자식을 결정할 수 있어 화학구조 결정에 매우 유용하다[2].

한편 Cordell과 신[3]의 보고에 의하면 하나의 활성물질을 분리하여 구조를 구명하는데 소요되는 경비가 $50,000이며 약 3개월이 필요하다고 발표된 바 있다. 특히 이때 분리하여 구조가 결정된 화합물이 기지화합물일 때는 이에 대한 투자는 거의 버려진 것에 불과하다고 하였다. 따라서 이를 극복하기 위하여 최근에는 짧은 시간내에 활성물질을 분리 확인하기 위하여 많은 노력을 하고 있으며 그 결과도 다수 보고되고 있다[3∼6]. 이와 같이 기지물질의 짧은 시간내 빠른 동정은 □dereplication"으로 알려진 하나의 과정으로 검색과정에서 특히 주요한 위치를 차지하게 되었다[3, 6]. 대표적인 것이 LC-MS[3]와 LC-NMR[4]법 등이며, LC-MS에 활성을 연계하여 활성 분획중에 함유된 성분의 확인을 시도한 보고도 있다[3]. 앞으로 이 분야에 많은 발전이 이루어져 더욱 짧은 시간내에 적은 경비로 화학구조가 밝혀질 날이 곧 도래할 것으로 믿는다.

다음에 이차 대사산물의 구조분석의 예를 식물에 함유되어 있는 주성분 가운데 하나인 saponin의 경우를 가지고 기술하고자 한다.

Saponin은 그 어원이 의미하는 대로  비누처럼 거품을 일으키며, 많은 경우 어독작용이 있고, 구조적으로는 당부와 비당부(aglycon, genin)가 서로 glycoside결합으로 연결되어 있어 산, alkali 또는 효소 등에 의해 분해된다. Saponin의 구조구명을 위해서는 다음의 몇 가지 문제를 해결해야 한다.

즉 1. 비당부의 구조결정

2. 당부에 있어서 구성하고 있는 단당류의 조성

3. 단당류간의 결합방식

4. 단당류의 anomeric configuration

5. 당부와 비당부의 결합위치 결정

Saponin의 비당부 즉 aglycon은 통상 triterpenoid라고 부르는 화합물군으로 구성되어 있다. Triterpenoid는 기본단위가 탄소 30으로 구성된 화합물군으로, 자연에 분포하고 있는 대표적인 화합물은 oleanolic acid, hederagenin같은 oleanane계 화합물들이다. 우리가 잘 알고 있는 인삼saponin의 경우는 protopanaxadiol 및 protopanaxatriol로 알려진 dammarane계 triterpenoid성분들이다. 이 aglycon성분은 가수분해시 비교적 산에 안정한 것이 대부분이지만 인삼saponin의 경우처럼 때로는 분해되어 진정한 aglycon의 화학구조를 결정할 수 없는 경우도 종종 있으므로 이 경우는 약한 산성이나 효소분해, alkali분해 등의 방법을 사용하여야 한다. 당의 종류를 결정하기 위해서는 보통은 TLC 또는 PC를 이용하여 표준품과 직접적으로 대조하여 결정하나, 이를 확인하기 위해서는 통상 GC나 HPLC 등을 이용하는 것이 일반적이다. 당의 결합비는 단당류를 정량하여 결정하기도 하지만 일반적으로는 FAB-MS에서 얻은 data를 이용하면 pentose, hexose, methyl pentose의 구성비를 쉽게 계산할 수 있다. 이때 NMR data을 추가적으로 이용할 수가 있다. 최근에는 당의 absolute configuration을 요구하는 추세로 전환되고 있다. 단당류간의 결합방식을 결정하기 위해서는 이전에는 화학적인 방법을 많이 사용하였으나, 검체가 많이 소요되므로 요즈음은 NMR 및 MS data을 주로 이용하고 있다. 이때 glycosidation induced shift rule을 적용하기도 하지만 최근에는 위에서 언급한 HMBC 방법을 쓰면 확실하게 결정할 수 있다. 단당류의 anomeric configuration의 결정도 NMR data에서 쉽게 얻을 수 있는 3JH1,2나 1JC,H값을 이용하여 결정할 수 있다. 당부와 비당부 사이의 결합방식은 통상 O-glycoside결합과, 산과의 ester결합의 두가지 형태로 이루워져 있는데 이는 NMR data로 쉽게 결정할 수 있다. 또한 당부분과 aglycon이 한 위치에서 결합하고 있는 monodesmoside인 경우에는 두 위치에서 결합하고 있는 bisdesmoside보다 비교적 구조결정이 용이하며, 당사이의 결합방식이 linear-chain 결합인 경우가 branched-chain 결합일 때보다 휠씬 용이하다. 최근의 보고에 의하면 10개의 단당류로 구성된 saponin의 화학구조를 NMR data만을 이용하여 결정한 예도 보고되었다[7,8].

식물(생물)에서 분리한 2차 대사산물에 관한 연구는 70년대까지는 주로 분리된 순수물질의 화학구조 결정이 주류이었으나, 이 후로는 식물엑스의 활성과 연계하여 활성물질을 찾아 이를 분리하고 이의 화학구조를 구명하는 소위 "bioassay-guided fractionation"법으로 전환되었다. 그러나 이때 사용하고 있는 활성검색은 주로 효소를 이용한 in vitro방법이 사용되고 있으므로 이의 단점을 보완할 수 있는 in vivo 실험을 위해서는 많은 양의 순수 화합물이 요구되고 있다. 이를 해결하기 위해서는 다량의 식물을 사용하여 이로부터 활성물질을 분리하거나 합성에 의존할 수밖에 없다.

저자는 우리 나라에서 자생하고 있는 약용식물(생약) 수십종에 관한 이차 대사산물의 분리 및 화학구조 결정에 관한 연구를 수행하여 왔다[9]. 본 심포지움에서는 이 가운데 최근의 연구결과의 일단을 발표하여 구조결정 방법의 한 예로서 제시하고자 한다.

인용문헌

1. Hostettmann, K., Marston, A. and Wolfender, J.-L. : in K. Hostettmann,

A. Marston, M. Maillard, and M. Hamburger(Ed.), "Strategy in the	search for new biologically active plant constituents", Oxford	University Press Inc., New York, 17 (1995)

2. 강삼식, 손건호 : 천연물성분 구조결정법, 서울대학교 출판부, 서울 (2000)

3. Cordell, G. A. and Shin, Y. G. : Pure Appl. Chem., 71, 1089 (1999)

4. Lindon, J. C., Nicholson, J. K. and Wilson, I. D. : Prog. NMR Spectro., 29,	1 (1996)

5. Cordell, G. A. : Phytochemistry, 40, 1585 (1995)

6. Corley, D. G. and Durley, R. C. : J. Nat. Prod., 57, 1484 (1994)

7. Kang, S. S. : Triterpenoid saponins, Seoul National University Press,

Seoul (1996)

8. Hostettmann, K. and Marston, A. : Saponins, Cambridge University Press,	Cambridge (1995)

9. 서울대학교 천연물과학연구소편 : 한국의 천연물과학 연구, 서울대학교

출판부, 서울 (1996)