탄수화물의 구조분석 및 동정

유은순

호남대학교 자연과학부

Structural Analysis and Identification of Carbohydrates

Eunsun Y. Yoon

Division of Natural Science, Honam Univ.

1 서론

자연계에 다양한 형태로 존재하는 탄수화물의 생물학적 측면의 연구는 최근 활발하게 진행되어 탄수화물의 생물학적 활성에 관한 중요성 및 새로운 면모를 부각시키는데 공헌하였다. 이미 밝혀진 생물학적 특성을 의약품 등으로 상용화하기 위하여, 또는 아직 밝혀지지 않은 새로운 활성을 이해하기 위하여 우선 탄수화물의 구조를 통한 형태적 특성을 알아보는 것과 구조와 활성을 연결짓는 연구 및 간편하고 신속한 구조 분석법을 개발하는 일도 병행하여 연구되어야 할 분야이다. 탄수화물 중 올리고당의 구조는 여러 변이요소, 즉 단위체인 단당류의 종류, 단당류의 연결순서, 아노머 형태, 단당류의 연결위치 및 단당류 자체가 오탄당인지 또는 육탄당인지에 따라, 또는 D-형인지 L-형인지에따라 좌우되므로 다른 생체 고분자화합물인 단백질이나 지질, 핵산 등의 구조변이 요소보다 그 복잡성이 더하다. 현재 이들 모든 구조변이 요소를 종합적이고 자세하게 측정할 수 있는 방법은 없으며 지금까지 효소를 이용한 분석법, 화학적 처리 후 HPLC를 사용하거나 질량분석기와 NMR분광법을 이용하여 구조변이 요소 중 한, 두 가지를 측정하여 왔다. 본 강연에서는 변이요소 중 연결부위만 다른 연결부위 이성질체 올리고당의 구조를 밝히기 위한 분석법으로 다양한 기법의 질량분석법과 NMR분광법에 기초를 두고 올리고당 구조의 신속한 분석법 개발에 관하여 설명하고자 한다.

2 본론

올리고당을 포함한 탄수화물의 구조연구는 다른 생체 고분자화합물인 단백질이나 핵산에 비하여 상대적으로 느리고 미비한 편이다. 그 주된 이유로는 탄수화물의 구조 및 합성이 매우 복잡하며, 그 복잡한 구조를 밝힐 수 있는 질량분석기(Mass Spectrometer)나 NMR(Nuclear Magnetic Resonance)과 같은 정밀한 분석기기의 발전이 최근에 와서야 이루어졌다는 점이다[1,2]

1) Conformation of Carbohydrates

탄수화물의 구조를 밝히는 일은 쉽지 않다. 다른 생체 고분자화합물인 단백질, 지방, 핵산 등의 구조 변이요소보다 훨씬 많은 가짓수인 주로 4가지 변이 요소에 의해  탄수화물의 구조가 결정된다. 즉 구성 단당류의 종류, 단당류의 연결 순서, 단당류간의 연결 시 아노머 형태, 단당류의 연결위치 및 구성단당류의 ring size에 의해 좌우된다. N개의 단당류가 있다고 할 때 여기서 나올 수 있는 구조이성질체의 수는 다음 식에 따른다.

S* = N! x 2aN x 4N-1 x 2rN

여기서 N은 각기 다른 단당류의 수를 표시하며, N!는 단당류의 배열순서(sugar epimer order)를,  2aN은 아노머형태(□형인지, □형인지를 구분하는 것), 4N-1은 단당류간의 연결부위(linkage position)를 나타내며, 2rN은 구성 단당류의 형태가 5탄당인지 6탄당인지(ring size)를 각기 나타낸다. 예를 들어 3가지 종류의 단당류에서 합성될 수 있는 분자량은 같고 구조만 다른 올리고당의 수(S*)는 윗 식을 적용하여 볼 때 S* = 3! x 23 x42 x 23 = 6,144가지가 나올 수 있다. 단백질의 경우, 3가지 아미노산에서 합성 가능한 peptide의 구조는 단지 3! = 6가지임을 고려하여 볼 때 탄수화물의 구조 연구가 타 생체 고분자 분야에 비하여 복잡하다는 것을 미루어 짐작할 수 있다.  좀 더 세밀하게 들어가면 D-형인지 또는 L-형인지도 고려하여야 하고, 단당류가 4개 이상 결합 시에는 분지화(branch)되는 위치도 고려해야 하므로 구조 이성질체의 수는 기하급수적으로 증가하게 된다.

같은 분자량을 지닌 올리고당이라 할지라도 구조가 달라지면 생체적, 화학적 또는 물리적 특성이 달라진다는 것은 잘 알려진 사실이며, 특히 아주 미세한 구조적 변화가 생체계의 기능이상 및 진화와 밀접하게 연관되어 있음을 감안하여 볼 때 올리고당의 구조와 기능을 연결시키는 연구는 큰 의미를 지닌다고 할 수 있다. 현재, 이들 모든 구조 변이요소를 종합적이고 자세하게 측정할 수 있는 방법은 없으며, 여러 분석기법을 이용하여 구조 변이요소 중 한, 두 가지를 분석하여 왔다. 여러 변이요소 중 연결위치에 따른 구조변화의 분석에 초점을 맞추어 살펴보고자 한다. 연결부위는 변이요소 중에서 가장 많은 이성질체를 낼 수 있는 변수이고 화학적으로 분석하기가 쉽지 않은 요소이다.

2) Analytical Methods

이제까지 탄수화물의 구조 중 단당류간의 연결부위를 밝히기 위해 사용되어 온 방법에는 효소분석법, hydrazine분해법을 거친 후 질량분석기를 이용하는 방법, partially methylated alditol acetate형태로 바꾼 후 GC-MS(Gas Chromatograghy-Mass Spectrometry)로 분석하는 방법, NMR 또는 탄뎀질량분석법을 이용하는 방법 등이 있다[2,3].

시료를 부분적으로 메틸화된 alditol acetate형태로 바꾸기 위한 전처리 과정으로 최소 15단계 이상의 chemical step을 거치게 되므로 많은 시간이 소요됨과 아울러 불순물로 인한 chemical noise를 유발시킨다. 또한 permethylated 유도체화 시킨 후 EI-MS(Electron Impact-Mass Spectrometry)로 분석하는 방법은 단당류의 경우에는 database화되어 있으므로 편리한 면도 있으나 연결부위 분석 시에는 연결부위뿐 아니라 ring cleavage도 일으키므로 분석에 곤란을 겪게 된다.

NMR 이용 시에는 분석에 요구되는 시료의 양이 충분해야 (□ level) 하지만 분석 후에도 시료가 파괴되지 않는다는 장점을 가지고 있다. 반면, 탄뎀질량분석기의 장점은 시료의 전처리 과정이 간단하며 1회 분석에 요구되는 시료의 양이 10∼20□정도로 아주 작다는 점이다.

질량분석법(MS : Mass Spectrometry)은 당의 종류, 숫자, sequence 및 조성등을 알아낼 수 있는 독특한 분석법으로[4] 시료를 이온화 시킨 후 분자이온과 각 분절이온의 질량 및 존재비율을 측정함으로써 시료의 구조를 밝힐 수 있다. 시료는 화학적 성질에 따라 EI(Electron Impact), CI(Chemical Ionization), GC(Gas Chromatograghy), LC(Liquid Chromatography)와 FAB(Fast Atom Bombardment)등을 거쳐 이온화 될 수 있으며 각 이온의 질량을 측정하는 방법에는 일단계 질량 측정법인 MS와 이단계 질량 측정법인 CAD MS/MS(Collision Activated Dissociation Mass Spectrometry/mass Spectrometry)방법이 있다.  이들 중 FAB이온화 방법은 올리고당과 그 유도체같은 비휘발성, 비극성물질의 분석에 이용되고 있다. FAB이온화 과정은 이온화실(ion source)내에서 일어나는데  FAB gun에서 나오는 가속화된 원자beam이 분석하고자 하는 시료를 포함하는 liquid matrix가 실려 있는 target으로 분사된다. 분산된 원자beam이 matrix와 충돌시, 충돌로 인한 운동에너지가 시료의 표면분자로 이동되어 많은 표면분자들이 진공상태인 이온화실내로 흩어진다. 표면 분자 중 많은 수가 흩어지는 과정에서 음이온, 양이온과 중성분자등으로 이온화된다. 이때 형성된 이온들 중에서 얻고자하는 정보에 따라 음이온이나 양이온을 선택적으로 택하여 그들의 질량을 측정함으로서 시료의 구조를 밝혀 낼 수 있다. 중성올리고당의 구조 연구에 양이온 FAB CAD MS/MS분석법을 적용한 결과, 분절이온의 비율에는 차이가 있었으나 연결위치에 따른 독특한 분절이온은 얻지 못했다. 반면, 음이온mode의 사용시에는 올리고당의 구성요소 중 가장 electronegative한 hydroxyl(-OH)기가 음이온을 띠게되므로 연결위치에 따라 독특한 분절형태를 더욱 잘 나타낼 수 있다[3,5].

3) 유도체화반응

다양한 구조정보를 얻기 위해 양이온 첨가, 메틸화, 아세틸화 등 간단한 시료의 유도체화 반응을 거친 후, 탄뎀 질량분석법(CAD MS/MS)으로 분석할 수도 있다. 탄뎀 질량분석법에서 얻어지는 이온들은 모두 mass-selected ion으로 부터 나오는 것으로 purification단계를 거치지 않아도 불순물로 인한 noise peak없이 미지의 시료 구조를 알아내거나 재조합하는데 이용된다. 특히, 탄뎀 질량분석법은 올리고당의 구조 중 연결위치를 밝히는데 유용하게 사용할 수 있는데 이는 올리고당의 구조 중 단당류간의 glycosidic결합이 화학적으로 가장 약하며, 또한 연결위치 이성질체의 종류에 따라 충돌에너지를 흡수하여 분자 진동에너지(vibrational energy)로 전환, 분산시키는 정도의 차이가 있으므로 충돌에너지 수준을 조절함으로써 glycosidic결합만을 끊어 연결위치를 구별해낼 수 있다[5].

3. 결론

질량분석기를 이용한 구조분석의 주안점은 구조를 유추하여 낼 수 있는 적절한  MS 분절이온을 찾아내는 것이다. 양이온 FAB 질량분석법를 이용하여 유도체화시키지 않은 올리고당의 분석시 나트륨와 결합된 형태의 분자이온 peak를 얻으며 MS/MS mode에서도 아주 작고 비선택적인 분절이온 밖에 얻지 못한 반면 음이온 FAB 질량분석법은 분자이온 뿐아니라 풍부한 분절이온을 얻을 수 있었다. 음이온 FAB mode를 사용하여 얻게된 분절이온들은 음이온을 가장 적절하게 안정화시킬 수 있으며, 양이온 FAB mode에서 얻은 이온들은 양전하를 가장 적절히 안정화시킬 수 있어 시료의 구조와 화학적 성질에 따라 각기 다른 스펙트럼을 얻을 수 있다. 음이온 및 양이온 mode의 이온화 방법외에, 시료를 메틸화 또는 아세틸화시키는 유도체화 반응 후의 FAB CAD MS/MS스펙트럼을 비교하면, 시료에 관한 보다 다양하고 보완적인 정보를 얻을 수 있다.

참고문헌

1. V. S. Raghavendra Rao, P. K. Qasba, P. V. Balaji and R. Chandrasekaran □Conformation of Carbohydrates", Harwood Academic Publisher, Amstergam, Netherlands(1998)

2. R. A. Laine,  "Tandem mass spectrometry of oligosaccharides." Methods in Enzymology 157-181(1989)

3. E. Yoon and R. A. Laine, "Linkage position determination in a novel set of permethylated neutral trisaccharides by collisional-induced dissociation and tandem mass spectrometry." Biological Mass Spectrometry 479-85(1992)

4. T. Kasama and S. Handa, "Structural Studies of Gangliosides by Fast Atom Bombardment Ionization Low-Energy Collision-Activated Dissociation, and Tandem Mass Spectrometry." Biochem. 5621-27(1991)

5. J. A. Carroll, D. Willard and C. B. Lebrilla, "Energetics of Cross-Ring Cleavages and their relevance to the linkage determination of oligosaccharides." Anal. Chim. Acta. 431-35(1995)