초임계 유체 추출과 제조용 HPLC를 이용한 귤껍질로부터 페릴릴 알코올의 분리

강 덕 희·이 종 호·노 경 호

이 윤 우*·김 재 덕*·이 윤 용*

인하대학교, 화학공학과

*한국과학기술연구원, 환경복원연구센터

Separation of Perillyl Alcohol from Orange Peel by Supercritical Fluid Extraction and Preparative High-Performance Liquid Chromatography

Duk Hui Kang·Chong Ho Lee·Kyung Ho Row

Youn-Woo Lee*·Jae-Duck Kim*·Youn Yong Lee*

Dept. of Chem. Eng., Inha University, Inchon 402-751, Korea

*Environment Remediation Research Center, KIST, Seoul 136-791, Korea

서론

페릴릴알코올(POH; NSC-641066)의 화학구조식은 C10H16O이며 p-me-ntha 1,8 -dien-7-ol, 1-Hydroxymethyl-4-isopropenyl-cyclohexene, 4-iso-propenyl-1-cyclohe-xene- 1-methanol로서 지칭되며, 감귤류에서 발견되는 물질로 d-리모넨의 수산기 유도체이다. POH는 모노테르펜으로 유방암등의 예방과 치료에 효과가 있다고 알려져 있다[1]. 또한, POH는 향수, 비누, 세제, 로션 등의 향료로서도 사용되고 있다. 페릴릴알코올을 얻는 방법에는 식물로부터 직접 추출하는 방법, 화학적 구조가 비슷한 물질부터 합성에 의해서 만들어 내는 방법, 박테리아와 같은 세균들로부터 세포배양에 의해서 얻는 방법등이 있다[2,3].

이산화탄소를 이용한 초임계 유체 추출법은 낮은 조업 온도와 용매의 잔류물질이 남지 않는 장점이 있고 용매 추출법보다 수율이 높다[4,5]. 또한 SFE에 이용된 이산화탄소는 무독성, 불연소성이다[6]. 본 실험에서는 초임계 유체 추출에 의해 한국산 귤껍질로부터 POH를 정제하기 위한 전처리 조건을 얻는 것이 연구의 목적이다. 이를 위해서 용매들의 용해도 차이를 이용하여, 용매의 종류와 조성을 변화시키며 실험하여 이 결과를 GC를 통하여 확인하였다.

불순물이 많이 포함되어 있는 추출물을 정제하기 위해서 분배과정과 open tubular chromatography (OTC) 단계를 거쳤다. 분배과정은 아세토나이트릴과 헥산을 사용하였다. 각각의 층에 용해되어 있는 POH의 양은 GC를 통하여 확인하였다.

역상 HPLC 시스템은 물을 기본용매로 사용하고 메탄올이나 아세토나이트릴를 부가적으로 사용한다. 초임계 유체 추출, 분배과정, OTC단계를 거친 시료에 대해서 제조용 HPLC를 사용하여 주입양과 순도를 더욱 높게 하는 것이 연구의 목적이다.

실험 방법

1. 이산화탄소를 이용한 초임계 유체 추출

본 실험에 사용한 초임계 유체 추출장치는 내부부피가 10 L (258mmOD x 870mmH), 두 개의 분리장치 (258mm OD x 545mm H), 4개의 열교환기와, 이산화탄소 재생 저장 장치로 구성되어 있다. 2kg의 귤껍질을 추출기 내부에 넣고, 펌프 (Milroyal 펌프, MCP13D10B1M, 최대유속=100□/ hr)를 이용하여 실린더의 이산화탄소를 추출기 내부에 주입한다. 추출기의 압력은 back pressure regulator로 조정하였다. 이산화탄소에 용해되어있는 오일층은 압력이 감소함에 따라 분리되어 분리장치에 수집된다. 오일층이 제거된 이산화탄소는 냉각되어 이산화탄소 재생 저장 장치로 회수된다. 추출 조건은 압력 200bar, 온도 50℃, 이산화탄소의 유량 6 CO2 kg/hr/kg 시료로 고정되었고, 추출시간은 14시간 동안 수행되었다.

2. GC 분석

본 실험에서는 Hewlett-Packard (HP) Model 5890에 HP-5 capillary column (Crosslinked 5% PH ME Siloxane, 30m×0.32mm)을 장착하고 검출기로 FID를 사용하였다. 오븐 온도는 50-80℃까지 10℃/min, 80-250℃에서 5℃/min으로 증가시켜가며 분석하였다. 주입기와 검출기의 온도는 각각 250, 300℃이었다. 유량은 1□/min 이고, split ratio는 1:50이다.

3. Open tubular chromatography (OTC)

분배이후의 추출물을 OTC(30 cm×2.5 I.D.)에 주입하고 출구에서 수집하였다. 역상 그리고 정상 OTC가 사용되었다. 정상 OTC는 silica 60 (40-63 □m, Merck)이 채워졌고, 이동상으로는 헥산/에틸 아세테이트 (90/10, vol.%)를 사용하였다. 역상 OTC는 C18 (40-63 □m, YMC)가 채워졌고, 이동상으로는 메탄올/물 (40/60, vol.%)이 사용되었다.  출구에서 수집된 방출물은 thin layer chromatography (TLC)를 이용하여 검출하였다. TLC의 검출에는 254 nm UV lamp가 사용되었다.

4. 제조용 HPLC

HPLC 시스템은 Waters 600s Multisolvent Delivery System이 부착된 Waters 616 liquid chromatography (Waters Associates, Milford, MA, U.S.A.), UV-visible dual □absorbance detector (Waters 2487), 그리고 Rheodyne injector (2ml sample loop)이 사용되었다. 데이터 수집은 Millennium 32 (V. 3.05, Waters, U.S.A)가 PC에 install 되었다. 이동상으로는 물, 메탄올, 아세토나이트릴이 사용되었다. 제조용 column(ODS, 15□m, 3.9×300mm)은 진공 펌프를 이용하여 채웠다. 이동상의 유속은 1.0ml/min으로 고정되었다. UV wavelength는 205nm로 고정하였다.

결과 및 고찰

한국산 귤껍질로부터 POH를 초임계 유체 추출법으로 추출하고, 분배단계, OTC로 정제단계, 그리고 마지막으로 제조용 크로마토그래피를 이용하여 분리하였다. POH를 포함한 귤껍질의 오일층을 초임계 유체를 사용하여 추출한 후 GC를 통하여 분석하였다. POH를 포함하는 초임계 추출물의 수율은 건조 분말을 기준으로 약 2% 이다. 또한 건조 분말을 기준으로 한 POH의 함량은 2.8×10-3 (wt.%)이고 용매추출법에 비해 30배정도의 높은 수율이다[3,4].

초임계 추출물은 매우 많은 불순물을 포함하고 있다. 이러한 불순물을 제거하기 위해서 초임계 추출물 10g을 아세토나이트릴/헥산 (80/20, vol.%)에 용해시켰다. 10g의 시료를 120ml 아세토나이트릴과 30ml의 헥산으로 분배하고, 각각의 층은 증발기를 사용하여 분리하고. GC를 통하여 분석하였다. 아세토나이트릴 층에 많은 양의 POH가 존재하며(Fig.1 a), 반대로 헥산층에는 극소량의 POH가 검출되었다(Fig.1 b). 아세토나이트릴층에는 POH뿐만 아니라 불순물역시 많이 포함되어 있고, 헥산층에는 POH의 양은 적지만 불순물이 많이 제거되었음을 알 수 있다(Fig1). 또한 HPLC의 전처리 단계로 OTC를 사용하였다. 역상과 정상의 packing을 채워서 POH의 흡착 특성을 찾기 위해서 실험하였다. 정상의 packing으로는 silica가 채워졌고, 역상의 packing으로는 C18이 채워졌다. 정상과 역상의 이동상의 조성은 각각 헥산/에틸 아세테이트 (90/10, vol.%), 그리고 메탄올/물 (40/60, vol.%)이다. 분리된 용출액은 thin layer chromatography를 통해서 검출하였다. 역상의 OTC를 사용했을 때 POH에 대한 선택성이 다소 높은 것으로 나타났지만, 용출시간이 길고, 수율이 낮았다. 결과적으로 수율과 경제성을 고려하여, 정상 OTC 가 전처리 단계로 선정되었다(Fig.2).

초임계 유체 추출법을 이용하여 한국산 귤껍질을 추출하고, 아세토나이트릴과 헥산을 사용하여 분배 단계를 거쳐서, OTC로 정제하였다. 좀더 순도를 높이기 위해서 제조용 HPLC 시스템을 사용하였다. 이동상의 조성으로는 물/아세토나이트릴 (50/50, vol.%)이였고, 이동상의 유속은 1.0ml/min으로 고정되었다. 전처리 단계를 거친 아세토나이트릴층의 시료 0.2ml를 주입하고, 제조용 크로마토그래피 column을 여러번에 거쳐서 정제하였다. 정제 과정을 거친 시료 0.1g을 메탄올 6ml에 희석시킨후, 5□l를 제조용 HPLC에 주입하였다. Fig.3에서 HPLC로 분리한 POH의 크로마토그램을 볼 수 있다. Fig3에서 알 수 있듯이 POH의 retention time은 16.03min이며, 매우높은 순도로 POH를 분리할 수 있었다.

참고문헌

1. Gould, M. N., J. Cell. Biochem., 22, 139 (1995).

2. 노경호, '액체 크로마토그래피의 원리와 응용', 인하대학교 출판부 (1999).

3. Jung, Y.A. and Row, K.H., J. Chromatogr., 828, 445 (1998).

4. Jung, Y.A. and Row, K.H., Korean J. Chem. Eng., 15, 538 (1998).

5. 이윤우, 김재덕, 이윤용, 정용안, 이종호, 노경호, □화학공학의 이론과 응용□, 4, 2 (1998)

6. 이종호, 정준영, 노경호, 이윤우, 김재덕, 이윤용, □화학공학의 이론과 응용□, 5, 2 (1999)

Fig.1  Chromatogram of POH after partition (a : acetonitrile phase, b : hexane phase)

Fig.2  Separation of POH from the    Fig.3  Chromatogram of purified    effluent by OTC with silica packing       POH by preparative HPLC