Cholesterol 생합성 억제 물질인 Mevinolin 생산 최적화 연구

이태범, 차월석, 정성록, 김주령, 정연홍

조선대학교 공과대학 화학공학과

Optimization of Mevinolin Production for Cholesterol Biosynthesis Inhibitor

Tae-Bum Lee, Wol-Suk Cha, Sung-Rock Jeoung, Ju-Roung Kim, Yun-Hong Jung

Dept. of Chem. Eng., Chosun University, Kwangju 501-759, Korea

1. 서 론

Cholesterol은 세포막을 구성하는 기본물질의 하나로서 생명체에 없어서는 안될 중요한 물질로서 생체의 cholesterol은 식사로부터 흡수되는 것과 생합성 되는 것이 있는데 주로 담즙산으로 배설되어 조절되고 있다. 사람의 경우 생합성양이 식사로부터 흡수되는 양의 3∼4배가 많다고 보고되고 있기 때문에 체내에서 생합성되는 cholesterol의 양을 조절하는 것이 혈중 cholesterol의 조절에 필수적인 인자라고 할 수 있다[1]..반응경로의 효소인 HMG CoA Reductase는 인체내의 생합성에서 결정적 단계인 HMG CoA가 mevanolic acid로 변환되는 단계에 작용하는 효소로서, 이 효소의 작용을 효과적으로 억제할 수 있는 물질을 개발하여 체내의 과다한 cholesterol의 양을 조절하려는 노력이 계속 이어지고 있다[2].

HMG CoA Reductase 억제제에 대한 연구는 1976년 Merck사의 Brown등[3]과 미국의 Albert[4], 일본의 Endo등[5,6,7]이 곰팡이균의 대사물질에서 분리한 mevinolin과 compactin등이 HMG CoA Reductase 억제제로서 효능이 있음이 알려진 뒤 혈중 콜레스테롤 감소제로 개발되어 Lovastatin이라는 상표로 시판되고 있으며, Pfizer, Rhone-Poulene Rorer, Bristol-Meyers Squibb사등에서는 CP-831101, Dalvastatin, BMY-21950을 HMG CoA Reductase 억제제로 개발중에 있다[8]. Mevinolin은 Fig. 1에 표시된것과 같은 구조를 가지고 있는 물질로서 화학식은 C24H36O5(lactone form)이며 분자량이 404인 화학물질이다. 그리고 mevinolin의 생화학적 특성으로는 cholesterol 생합성 저해 작용을 하는 물질로서 동맥경화, 고지혈증등 cholesterol의 축적을 저해시키는 물질이며 이러한 원인에 의해 발생되는 질병을 치료하는 의약품으로 개발 사용되고 있다. 그러므로 본 연구에서는 곰팡이인 Penicillium citrinum을 이용하여 콜레스테롤 생합성 억제물질인 mevinolin의 생산 수율을 높이는 최적 배양조건을 규명하고자 한다.

Lactone form                   Acid form

Fig. 1. Structure of mevinolin.

2. 실 험

2.1. 배지조성

배지는 Table 1, 2에 표시한 배지를 냉장보관하여 사용하였다.

Table 1. The composition of medium(g/□)

Glucose(Difco)	20g/□
Peptone(Difco)	10g/□
Malt extract(Difco)	20g/□
Agar(Difco)	20g/□
pH 6.5

Table 2. The composition of preculture(g/□)

Glucose(Difco)	40g/□
Peptone(Difco)	2g/□
NaNO3(Shinyo)	2g/□
Yeast extract(Difco)	1g/□
MgSO4·7H2O(Samchun)	1g/□
pH automatic

2.2. Instrumental condition of HPLC

Typical	Conditions
Model	영린SDV30 PLUS
Eluent	77% methanol 0.1% acetic acid 0.1% triethyl amine 22.8% water
Flow rate	1.0□/min
Column	□Bondapak C18 125Å 10□ 3.9 × 300mm(Waters)
Temperature	28℃
Detection	UV detector(236□)
Pressure	600psi
Injection vol.	50□

2.3. Mevinolin 분석

Mevinolin 분석은 메탄올 추출법에 의하여 HPLC로 분석하였다. 배양액 2□와

methanol 2□을 1분동안 shaking 한 후 3000rpm으로 30분간 원심분리한 뒤 상등액을 0.45□의 membrane filter로 여과한 후 micro syringe를 사용하여 여과액 50□를 HPLC로 주입하여 분석하였다. Mevinolin의 standard curve는 Fig. 2에, 발효조에서 배양한 액체배지의 peak는 Fig. 3에 각각 나타내었다.

Fig. 2. Standard peak of mevinolin(400ppm). Fig. 3. Sample peak by Penicillium citrinum.

3. 결과 및 고찰

Mevinolin을 생산하기 위하여 Penicillium citrinum Thom을 이용하여 배양시간에 따른 세포성장, pH 변화, glucose 농도, mevinolin 생성량, 온도 변화, 초기 pH 변화, 탄소원 효과, 질소원 효과, mineral 효과, glucose 농도변화, 회분배양에 따른 mevinolin 생성의 발효결과, 세포성장 최적 pH는 3.9이며, mevinolin 생성을 위한 최적배양 온도는 24℃였다. 탄소원들 중 glucose가 mevinolin 생성이 가장 많았으며, 가장  effective한  질소원은 peptone이었다. Mineral 종류의 효과로서는 K2HPO4가 mevinolin 생성이 가장 우수하였고, 배양중에 오일 침전 물질이 세포를 둘러싸 공기를 차단해서 세포성장을 저해하며 mevinolin 생산을 억제하므로 이를 녹이기 위한 계면활성제 첨가효과를 검토한 결과, 비이온계인 Tween 20은 계면활성제를 첨가하지 않을 때보다 28.6%, Tween 80은 22.9%, Tween 40은 17.1% 더 많은 mevinolin 생성량을 나타내었다. 회분배양 일때는 배양 6일에서 최대 세포성장을 보였으며 최대 mevinolin 생산은 배양 8일에 10.3□/□로 최대치였다.

Fig. 4. Time course of cell growth and mevinolin  Fig. 5. Time course of glucose concentration

production by Penicillium citrinum at batch         and change of pH by Penicillium cit-

culture.                                          rinum at batch culture.

Table 3. The cell growth and by product formation at batch culture

glucose (g/□)	Xm (g/□)	□m (mg/□)	YX/S (g/g)	Y□/S (mg/g)	[eqn: rm mu_m = 1 over X { ( {DELTA ```X} over {DELTA ``` t} ) }_max] (g/g-hr)	[eqn: rm upsilon _m = 1 over X { ( {DELTA ``` alpha } over {DELTA ``` t} ) }_max] (mg/g-hr)
100	26	10.3	0.288	0.103	0.052	0.016

Xm = maximum cell density

□m = maximum mevinolin concentration

YX/S = maximum cell yield

Y□/S = maximum mevinolin yield

[eqn: rm mu_m] = maximum cell specific production rate

[eqn: rm upsilon _m] = maximum mevinolin specific production rate

4. 참고문헌

1. J. M. Dietschy, J. D. Wilson, N. Engl., J. Med., 292, 1179(1970)

2. S. C. Stinson, Chem. & News, Oct. 3, 35(1988)

3. W. K. Wilson, K. S. Wang, A. Kisic and G. J. Schroepfer, Chem. Phys.          Lipids, 47, 273(1988)

4. A. W. Alberts, J. Chen, G. Kuron, V. Hunt, J. Huff, C. Hoffman, et al,        Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 77, 3957(1980)

5. G. J. Schroepfer, E. J. Parish, H. W. Chen and A. A. Kandutsh, J. Biochem.,      252, 8975(1977)

6. ENDO. A., M. Kuroda and Y. Tsujita, J. Antibiotics, 29, 1346(1976)

7. ENDO. A., J. Antibiotics, 32, 852(1979)

8. 장문호, 정밀화학, 24, 10(1992)