효소 탈묵공정을 위한 수식효소 고분자에 관한 연구

이주한, 이성남, 박귀남, 박진원

연세대학교 화학공학과

A study of new copolymer of modified enzyme

for enzymatic deinking process

Lee, J.H., Lee, S.N., Park, K.N., Park, J.W.

Department of Chemical Engineering Yonsei University

서론

전세계적으로 문제가 되고 있는 자원의 고갈 및 환경 보호를 위하여 고지의 재생 및 재활용에 대한 인식이 고조되고 있다.

최근에는 셀룰라아제를 이용한 탈묵의 유용성에 대하여 알려지면서 이를 이용한 공정개발에 대하여 많은 관심을 갖게 되었다. 효소이용 탈묵공정은 폐지의 과다한 펄프손실과 폐수처리 문제를 유발시키는 강알카리법 대신에 온화한 중성조건에서 펄프섬유의 해리특성을 나타내는 셀룰라아제를 이용하여 고지에 부착되어 있는 잉크를 효과적으로 박리시키고저 한다. 더욱이 세정 및 floatation에 사용되는 중요한 약품 중의 하나인 계면활성제를 셀룰라아제에 공유 결합시켜 공중합고분자 수식셀룰라아제의 형태로 제조한 연구결과가 있다.(1)(2)(수식셀룰라아제는 셀룰라아제의 고정화 형태로서 내구성, 내열성 및 내pH성을 갖고 있으며 효소의 특성과 고분자의 특성을 함께 가지고 있다. 이전 연구에 고분자 수식셀룰라아제를 이용하여 고지펄프의 탈묵공정에 도입하여 효소의 수식에 사용되었던 AKM-0530은 효소의 안정화를 위하여 개발된 약품이었으므로 거품 생성력이 많이 떨어진다. 이에 보조계면활성제를 사용하여 거품발포능력을 향상시켰으나 이는 수식셀룰라아제 이외의 약품을 투입하는 것으로서 공정의 단순화를 저해시키는 요인이 된다. 따라서 수식이 가능한 새로운 고분자를 선정하거나 개발이 필요하게 되었다. 수식이 가능하려면 ① 수용성, ② 효소의 amine기와 결합할 수 있는 maleic기가 있어야 하고(3), ③ 발포능력이 좋아야 하며, 그리고 ④ 거품발포능력은 pH를 조절하지 않는 상황, 즉 중성 조건에서 가장 뛰어나야 한다.

본 연구는 수식에 적합한 성질인 수용성이며, 초기 및 후기 발포성이 뛰어나야 하고, 효소의 아민기와 결합할 수 있는 관능기를 갖춘 고분자를 제조하는 것이다.

실험재료 및 실험방법

재료

본 실험에 사용한 셀룰라아제는 일본 Yakurt사의 상품명 onozuka cellulase Y-NC를 사용하였다. 셀룰라아제의 활성의 단위는 FPase 활성도로 나타내었다. 표준 당화기질로서는 여과지 FP-5C (Toyo Roshi Ltd. Japan)를 사용하였으며 50℃, pH 5.0에서 셀룰라아제의 활성은 0.19 unit/mg이었다. 환원당농도 측정은 dinitro salicylic(DNS) acid 발색법을 사용하였다(4). 또한 고분자 제조에 필요한 Polyethylene oxide(PEO)의 ethylene oxide(EO) 중합도를 각각 10, 20, 30, 40 바꾸면서 사용하였다.

실험방법

·고분자 합성

효소 수식을 위한 고분자는 효소의

아미노기와 말레일화 반응하는 무수

말레인산기를 가지는 폴리에틸렌옥사

이드 공중합체이다(5). Fig 1에 자체

개발 공중합 고분자 합성 공정도를

나타내었다. PEO allyl alcohol을 합성한 후 Lauric acid로부터 PEO allyl ether를 합성하였다. 끝으로 PEO 유도체와 무수말레인산으로 구성되는 공중합체를 합성하였다.

·효소와 고분자 수식반응

공중합 고분자 내의 무수 말레인산기와 셀룰라아제의 아미노기 사이에

말레일화 반응이 기대된다. 효소 수식

반응은 4℃ 효소용액에 가공용 고분자를 첨가, 교반하여 실시하였으며 pH조절용 0.5M NaOH 첨가하에서 2시간동안 행하였다. 고분자 수식효소의 수식율은 미수식효소의 아미노산  농도에 대한 수식효소의 잔유 아미노산 농도의 비로 정의하였으며 효소의 아미노기 농도는 TNBS법으로 분석하  Fig 1.  Flow diagram of copolymer synthesis 였다. 수식효소의 수식율은 효소와 수식 고분자의 중량비로 조절하였다.

결과 및 고찰

1. 합성 고분자의 특성

알릴알콜에 에틸렌옥사이드의 부가반응은 알칼리촉매인 KOH존재 하에 70℃에서 4hr동안 고압반응기에서 행하였다. EO 10mol 부가품은 상온에서 액상 이였으며 부가몰수가 20mol이상 일 때는 paste상이 되었으며 부가몰수가 증가할수록 pH가 낮았다. (Table 1) 알릴알콜의 EO 부가품과 라우릭산과의 에테르반응(6)은 산 촉매인 □-toluene sulforic acid와 산화방지제로 차아인산소다를 사용하였다. EO 부가몰수가 증가할수록 반응온도가 낮았고 pH도 낮게 나왔으며, melting point는 EO 부가몰수가 증가할수록 높았다. 평균전화율은 약 90% 정도였다. 분석결과는 Table. 2와 같다. 알릴에테르(10)의 온도의 변화에 따른 전화율과 산가의 변화를 Fig 2에 나타내었는데 240℃ 이상의 고온에서 반응을 완결지었다. 알릴 에테르와 무수말레인산의 중합반응에서는 중합 개시제로 BPO를 사용하였고 공기접촉으로 인한 산화를 방지하기 위해서 N2 가스를 주입하였으며, 용매로는 톨루엔을 사용하였는데 합성품의 색상은 짙은 갈색 이였다. FTIR, FTNMR로 구조분석을 실시 한 결과 만족할 만한 공중합 고분자 생성을 확인하였다. Table 3에 공중합 고분자의 화학적 구조 및 중합도 n값에 따라 에틸렌 옥사이드 사슬길이가 변하는 것을 나타내었다.

Table 1. Analysis of Allyl Alcohol      Table 2. Analysis of Allyl Ether

	Allyl Alcohol (10)	Allyl Alcohol (20)	Allyl Alcohol (30)	Allyl Alcohol (40)
E.O mol number	11.0	21.87	30.81	39.55
Molecular Weight	544.76	1020.56	1413.81	1798.08
Hydroxyl Value	103.0	54.97	39.68	31.2
pH	6.31	6.20	6.00	5.73
Color	APHA20	Gardner1	Gardner1	Gardner1

	Allyl Ether (10)	Allyl Ether (20)	Allyl Ether (30)	Allyl Ether (40)
Acid Value	3.3	3.26	4.55	4.37
Sopanifi-ation Value	75.07	50.98	37.86	29.72
pH(1% sol'n)	4.45	4.30	4.25	4.10
Melting Point(℃)	-	35.0	43.5	49.5

Table 3. Characteristics of synthetic copolymers

	MA-PEO(10)	MA-PEO(20)	MA-PEO(30)	MA-PEO(40)
n	11	21.9	30.8	39.6
MW	826	1308	1695	2080

2. 수식 셀룰라아제의 제조

수식제 공중합고분자를 셀룰라아제 Y-NC와 말레일화 반응을 하여 수식시킨 결과와 잔존 활성도를 Fig.3에 나타내었다. 공중합고분자내의 EO 부가몰 수가 증가함에 따라 수식율이 감소하였는데 이는 고분자의 크기가 커짐에 따라 hindrance effect에 의한 것으로 생각된다. 또한 잔존활성도는 수식율과 반대의 경향을 보였는데 이것은 수식율이 높을 때의 잔존활성도는 낮아짐을 나타낸다. 즉, 수식에 의해 고정된 효소는 수식율이 40%이상의 수치를 가짐에 불구하고 높은 활성을 유지할 수 있었다.

또한 셀룰라아제와 고분자의 결합으로 변화가 예상되는 수식 셀룰라아제의 분자량을 측정하였다. 분자량 측정은 거대 분자량이 먼저 검출되는 GPC분석법으로 행하였다. 분자량이 각각 약 32200와 19900인 두 그룹으로 나타났으며 고분자 수식 후 수식셀룰라아제는 분자량 분포가 128800∼288400으로 분자량의 증가가 나타났다. 이 결과 셀룰라아제는 합성한 수식제 고분자와 화학 결합 함을 알 수 있었다.

Fig 2. Acid value and Conversion          Fig 3. Relative FPase activity and

from Allyl Alcohol(10) to Allyl Ether(10)    degree of modification using copolymer

(MA-PEO(10)) and cellulase

References

1. Park, J. W. and Kajiuchi, T. 1995. Development of effective modified cellulase for cellulose hydrolysis process. Biotechnology and bioengineering. 45: 366-373.

2. Kajiuchi, T. and Park, J. W. 1992. Characteristics of cellulase modified with a copolymer of polyethylene glycol derivative and maleic acid anhydride.  Journal of Chemical Engineering of Japan. 25(2): 202-269.

3. Butler, P. J. G., Harris, J., and Hartley, I. 1969. The use of maleic anhydride for the reversible blocking of amino groups in polypeptide chains.  Biochem. J. 112: 679-684.

4. Miller, G. L. 1959. Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar. Anal. Chem. 31: 426-428.

5. Inada, Y. et al. 1986. Application of polyethylene glycol-modified enzymes in biotechnological processes: Organic solvent soluble enzymes. Trends  Biotechnol. 4: 190-194.

6. Nishio, T. et al. 1987. Terpene alcohol ester synthesis by polyethylene glycol-modified lipase in benzene.  Biotechnol. Lett. 9: 187-190.