Lactic acid 생산을 위한 2단식 동시당화발효공정

최실호, 우창호, 박준호, 윤현희

경원대학교 공과대학 화학공학과

A Two-Zone Simultaneous Saccharification and Fermentation Process for Lactic Acid Production

Sil Ho Choi, Chang Ho Woo, Jun Ho Park and Hyon Hee Yoon

Department of Chemical Engineering, KyungWon University

서론

Lactic acid는 기존의 식품, 의약, 유기화합물의 1차적 원료뿐만 아니라, 최근 들어서는 -OH, -COOH 두 개의 작용기로 이루어진 구조적 특성으로, 다양한 물리, 화학적 성질을 지닌 고분자 단량체로써 그 활용도가 크게 증가하고 있다.

현재 lactic acid는 세계 총생산량의 50% 이상이 glucose 또는 sucrose를 기질로한 미생물 발효방법으로 생산되고 있다.[1] 최근에는 원료비용 절감을 위하여 섬유성바이오매스를 원료로 사용하는 연구가 활발히 진행되고 있다. 섬유성바이오매스로부터 lactic acid의 생산방법으로 동시당화발효방법(Simultaneous Saccharification and Fermentation, SSF)이 주로 사용되고 있다. SSF공정의 장점은 cellulase 효소에 대한 glucose의 저해를 최소화하여 효소당화속도가 증대되고 따라서 고가의 효소사용량을 줄일 수 있다는 것과 공정이 단순화 된다는 것이다. 반면에 SSF의 단점은 첫째 당화와 발효가 각각 최적 조건이 아닌 상태에서 조업된다는 점과 둘째 cellulose 고형물로 인하여 생성물 제거가 어렵다는 것이다. 이러한 문제를 해결하는 방법으로 당화와 발효를 분리하여 각각의 최적조건에서 조업하므로서 생산성을 높일 수 있는 2단식 동시당화 발효공정이 제안 되었다.[2] 각 반응기의 온도는 따로 조절되며, 두 반응기의 반응물을 순환시키므로서 동시당화발효반응이 진행된다. 이러한 반응기는 고형물인 cellulose 입자 때문에 공정내에서 생성물의 추출제거가 방해되는 문제점이 해결된다. 본 연구에서는 2단식 동시당화발효공정 개발의 첫 단계로 충진탑을 이용한 효소가수분해공정과 고정화 균주를 이용한 발효공정의 조업특성을 조사하였다.

재료 및 방법

효소 및 균주

Cellulose 및 신문지의 가수분해 효소로는 Celluclast 1.5L과 Novozyme-188(□-glucosidase)를 4:1의 비율로 혼합하여 사용하였으며 이 복합효소의 enzyme activity는 96 IFPU/mL 이었다. Lactic acid 생산균주는 Lactobacillus delbreukii (NRRL-B445)를 사용하였고, Elliker broth(Difco) 배지를 사용하여 37℃, pH 6.4에서 3일간 계대배양하여 발효실험에 사용하였다.

효소가수분해실험

회분식 flask 효소가수분해 실험은 200ml의 유리병에 100ml의 sodium citrate와 citric acid를 이용한 pH 5.0, 5.5, 또는 6.0의 완충용액을 사용하여 50℃에서 수행하였다. 기질은 50g/L(□-cellulose, 신문지), 효소는 25 IFPU/g cellulose을 주입하였다. 2단식 동시당화발효를 위한 순환식 충진탑반응기를 이용한 효소가수분해실험은 직경 20mm 길이 300mm의 glass column에 신문지 50g/L를 충진하여 peristaltic 펌프로 15mL/min의 유속으로 효소 및 완충용액을 순환시키면서 수행하였다.

균주고정화 및 Lactic acid 발효실험

Lactic acid 균주의 고정화 방법은 다음과 같다. 종균배양액 40mL를 채취하여 원심분리(5000rpm)한 후 D.I water로  현탁한다. 이 과정을 3, 4회 반복하여 원심분리하고 얻어진 cell을 2.5%의 sodium alginate에서 균질화하고 이를 다시 3%(w/v)의 CaCl2·2H2O용액에 pasteur pippet과 peristaltic pump를 이용하여 적하시키면 직경 2mm 정도의 고정화 균주가 형성된다. CaCl2·2H2O용액내에서 4시간 동안 안정화된 균주는 다시 37℃ Elliker broth에서 40시간 가량 배양성장시킨다.[3]

발효실험에서 사용한 배지의 조성은 glucose 10∼50g/L, yeast extract 15g/L, K2HPO4 0.5g/L, KH2PO4 0.5g/L, CH3COONa·3H2O 1g/L, MgSO4·7H2O 0.5g/L, MnSO4·7H2O 0.05g/L, ammonium citrate 1g/L, FeSO4·7H2O 0.03 g/L이었다[4]. 배지는 121℃ 15psig에서 20분 가량 멸균하여 사용하였으며 배지의 침전 및 갈변화반응을 방지하기 위하여 배지성분을 포도당, 질소원, 무기염별로 나누어 멸균하였다. Free cell을 이용한 발효실험은 종균배양액 10%(v/v)를 접종하고 초기 pH를 6.3으로 조절하였으며, 탄산칼슘(CaCO3)을 첨가하여 pH 5.5를 유지하였다. 고정화균주를 이용한 발효실험에서는 10%의 종균배양액 대신에 2.5%(v/v)의 고정화 균주를 사용하였다. 발효온도는 42℃이었다.

동시당화발효실험

동시당화발효실험에 사용한 배지는 발효실험에서 사용한 배지에서 glucose 대신에 □-cellulose 또는 신문지를 기질로 사용하였고, 효소는 25 IFPU/g cellulose를 주입하였으며, 균주는 2.5%(v/v)의 고정화 균주와 free cell 10%(v/v)를 각각  사용하였다. 실험은 200mL glass bottle에서 온도 45℃, pH 5.0의 조건에서 120 rpm으로 이루어졌으며, 동시당화발효중에 발생하는 lactic acid로 인한 pH 변화는 CaCO3를 첨가하여 조절하였다.

분석

발효액의 당성분 및 lactic acid 함량은 HPLC로 분석하였다. 사용한 column은 HPX-87H(Bio-Rad)이고 이동상은 0.005M H2SO4 이었다.

결과 및 고찰

효소가수분해실험

효소가수분해 실험에 사용한 □-cellulose 와 신문지의 성분은 Table 1과 같다. 이와 같은 □-cellulose와 신문지를 사용하여 효소가수분해반응의 최적조건을 조사하였다. Fig. 1은 50℃에서 pH 변화에 따른 가수분해속도를 관찰한 것이다. Fig. 1에 나타난 바와 같이 pH 5.0, 5.5, 6.0에서 digestibility가 각각 72%, 68%, 53%로서 최적 pH는 5.0임을 알 수 있었다.

Fig. 2는 순환식 충진탑반응기를 사용한 효소가수분해실험을 수행한 결과이다. 기질은 신문지이었다. Fig. 2에 나타난 바와 같이 충진탑반응기에서의 효소가수분해반응과 회분식 flask 반응에서의 효소가수분해반응의 digestibility가 각각 47%와 49%로서 서로 유사한 것으로 관찰되었다. 따라서 효소가수분해와 발효를

Table 1. Comparison analysis for □-cellulose and news paper

Substrate	% Glucan	% Xylan	% Lignin	% Ash
□-cellulose	79.5	20.5	0	0
Newspaper	62.6	23.9	9.1	5.4

분리하여 수행하는 2단식 동시당화발효반응장치에서 순환식 충진탑반응기를 효소가수분해반응기로 사용할 경우 가수분해성능이 저하되는 문제는 없을 것으로 판단된다.

Lactic acid 발효실험

Fig. 3은 free cell과 고정화 균주에 의한 lactic acid 발효성능을 비교한 것이다. 발효실험은 pH 5.5와 42℃에서 이루어졌다. 초기에는 free cell에서의 glucose 소비량과 lactic acid 생산량이 최대 15%가량의 차이를 보인다. 이는 고정화 균주의 capsulation 효과에서 오는 균주와 기질간의 물질 전달 저항에 의한 것으로 판단된다. 그러나 반응시간이 경과함에 따라 고정화 균주의 발효성능은 free cell의 성능에 근접하는 것으로 나타났다. free cell의 specific growth rate는 0.274이었으며, free cell과 고정화 균주의 최종 lactic acid 수율은 96%이상이었다.

Cellulose 및 신문지를 이용한 동시당화발효실험

Fig. 4는 □-cellulose 및 신문지의 동시당화발효특성을 보여주는 것으로서, 초기 12시간에서는 free cell에서의 동시당화발효속도가 고정화 균주에 비하여 각각 0.65g/L-h와 0.28g/L-h로 2배이상의 차이가 난다. 하지만 시간이 경과함에 따라 고정화 균주와 free cell의 lactic acid 생성량이 유사하였다. □-cellulose를 기질로한 동시당화발효의 최종 lactic acid 수율은 고정화균주나 free cell을 사용한 경우 모두 약 77% 이었다. 신문지를 기질로 사용한 동시당화발효에서는 고정화균주의 경우 52% 이었고 free cell의 경우 42%로 나타났다. 본 실험에서 사용한 초기 기질농도는 30g/L 이었으며, lactic acid 수율은 □-cellulose 또는 신문지 내의 glucan 함량(Table 1 참조)을 기준으로 계산하였다. 이러한 결과로, 고정화균주를 동시당화발효에서도 효과적으로 사용될 수 있을 것으로 판단된다.

당화효소와 lactic acid 균주의 최적 조업온도는 각각 50℃와 42℃로서 서로 다르다. 따라서 2단식 동시당화발효의 목적은 당화와 발효반응을 각각의 최적온도에서 수행하며 두 개의 반응기에서 반응물을 순환시키므로서 동시당화발효반응이 진행된다. 이때 각 반응기의 온도는 따로 조절된다. 이러한 반응장치를 위하여 충진탑반응기를 이용한 순환식 효소가수분해장치와 cell free 발효용액을 순환시키기 위한 고정화균주를 이용한 발효반응에 관한 기초실험을 수행하였으며 현재 이와같은 두 개의 반응장치를 연결하여 동시에 효소가수분해와 발효를 수행하고 있다.

참고문헌

[1] Litchfield, J. H., Adv. Appl. Microbial, 42, 45∼96 (1996)

[2] Lewis, P. V., and Yang, S., Biotechnol. Prog., 8, 104 (1992)

[3] Stenroos, S. and Linko, P., "Production of L-Lactic acid with Immoblized     L.delbreuckii", Biotech. Letters, vol.4, 3, 159∼164 (1982)

[4] Yoo, I. K., "Lactic acid production and By-products Formation by High       Density culture of L. casei", Ph.D. Thesis, Dept. of Chem. Eng., KAIST       (1996)

Fig. 1. Effect of pH on Hydrolysis with            Fig. 2. Comparison of Hydrolysis in flask-

cellulose & Newspaper                             batch and column

Fig. 3. Comparison of fermentation with             Fig. 4. Comparison of SSF with cellulosic

free cell and Immobilized cell                       materials and two type cell