콜라젠 bead를 이용한 간세포 구상체의 고정화 기술 개발

김성포, 이두훈, 양성문, 박정극

동국대학교 공과대학 화학공학과

Development of Hepatocyte Spheroids

Immobilization Technique Using collagen-gel bead

Sung-po Kim, Doo-Hoon Lee, Sung-Mun Yang, Jung-Keug Park

Department of Chemical Engineering Dongguk University

서론

간세포의 단층배양보다는 3차원적인 집합체를 이루도록하는 구상체 형태로 배양하는 것이 간세포 및 간조직의 morphology와 생존력, 간기능 면에서 우수함이 국외연구현황(1) 뿐 아니라 본 실험실에서(2)에서도 그동안의 연구를 통하여 증명되었다. 그러나 이 간세포 구상체는 정체된 배양상태에서 그 간기능이 우수한 물성을 보였으나 결국 인공간 개발을 위해서는 이를 scale-up해야하기 때문에 일반적인 suspension방식의 생물반응기에서 배양할 경우 공정상의 교반 및 흐름등으로 유발되는 shear에 의해 간세포 구상체의 손상을 초래하였다. 이러한 손상을 줄이기 위해 간세포 구상체를 고정화하는 방법으로 최근 많이 연구되고 있는 encapsulation기술을 이용하였으며, 고정화 재료로서 콜라젠을 사용하였다. 콜라젠은 간세포에 매우 적합한 세포외기질이며, collagen gel embedding(3)등의 실험에서 그 우수함이 증명되었다.  본 연구의 목적은 간세포 구상체를 형성한 후 이를 콜라젠 젤에 embedding하여 고정화하는 기술(4)을 개발하는 것으로 scale-up시 발생하는 shear 및 물질전달 저항등의 문제점을 개선하고 체외순환형 보조장치의 설계시 고려해야할 반응기 부피를 줄일수 있도록 bead내의 구상체 접종농도를 높임으로써 향후 인공간 개발을 위한 기초 데이터를 확립하는것이다.

재료 및 방법

쥐 간세포의 분리

간세포의 분리는 Seglen-method(5)에 기초를 둔 변형된 방법인 collagenase perfusion방법을 사용했으며, 세포농도와 생존도는 trypan blue dye exclusion 방법과 hemacytometer를 이용하였다.(6)

간세포 구상체 배양

간세포 배양에 사용한 배지는 무혈청 배지로서 기본배지로는 William's Medium E(Gibco BRL)을 사용하였으며 여기에 EGF와 insulin을 추가했다. Spinner flask에서 일차배양으로부터 얻은 간세포를 5×105cells/ml 농도로  접종하여 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양한다.(6)

간세포의 고정화

미리 배양된 간세포 구상체를 pH7.2-7.4의 60mM의 calcium이 든 배지용액과 함께 collagen(10mg/ml)용액에 넣어 분산시킨 후 23G의 끝이 무딘 주사기 바늘을 통하여 0.75%(w/v)의 alginate용액으로 떨어뜨려 바깥층에 Ca-alginate 피막을 가진 collagen bead를 만든다. 그리고 37℃에서 45분간 방치하여 collagen을 젤화(gelation)시키고, 이것을 sodium citrate buffer에 10분간 넣어서 바깥층의 alginate피막을 녹여낸다.(4) 이때 형성된 bead는 spinner flask에서 5×105cells/ml of media의 cell density로 배양되었으며, bead내의 cell density는 각각 1×107, 2.5×106cells/ml of gel volume이다.

간세포 구상체의 간기능 활성도 측정

배양된 간세포의 detoxification능력을 조사하기 위하여 암모니아의 분해속도를 아산제약의 indophenol kits를 사용해서 측정하였다. 암모니아의 제거속도를 측정하기 위해서 배양2일째부터 1mM NH4Cl을 첨가한 배지를 사용하였다. 간세포의 중요한 대사기능의 하나인 알부민의 합성 및 분비는 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)법을 사용하였다.(4,6)

결과 및 토론

간세포 구상체 고정화

collagen bead는 Ca2+이온이 포함된 collagen용액을 alginate용액에 떨어뜨려 bead를 형성시키는 것으로 bead형성여부가 collagen과 alginate의 농도에 크게 영향을 받았다. 여기서 collagen과 alginate의 최종농도는 각각 0.8%와 0.75%이며 이 조건에서 안정하게 bead가 형성되었다. Fig.2는 위의 방법으로 제조된 collagen bead와 SCB로 피막을 제거한 후의 사진이다. 10분 미만의 처리로 피막은 완전히 제거되었으며, 내부의 collagen은 젤화되어 3주이상 그 형태를 계속 유지하였다.

(A)

(B)

Fig. 2. Light microscopic photographs of hepatocyte spheroid encapsulated in collagen-gel bead. Bar indicate 400□. (A) Hepatocyte spheroids in collagen bead with Ca- alginate shell (↔), 40× (B) Collagen bead after removal of Ca-alginate shell. 40×

간기능 활성도 측정

간세포의 중요한 대사기능의 하나로, 간에서 분비되는 단백질의 40%이상을 차지하는 알부민의 경우, in vitro배양에서 그 기능을 쉽게 잃게 되는데, Fig.3에서 보듯이 collagen bead의 피막을 제거함으로서, 배양초기에 물질전달 저항을 줄이는 것이 월등히 높은 알부민 분비수준을 유지할 수 있음을 알 수 있다. 이는 간세포가 기질내에서 부착등의 안정화되는 데 있어서 배양 초기에 산소요구량이 크다는 다른 연구진들의 결과(7)와도 일치한다고 볼 수 있다.

Fig.3. Albumin secretion rate of hepatocyte spheroids immobilized in collagen-gel beads with Ca-alginate shell and without Ca-alginate shell.

Fig. 4는  고정화하지 않은 구상체와 collagen bead내의 cell density에 따른 알부민 분비능과 암모니아 제거능을 비교한 것이다. 고정화 하지 않은 구상체의 경우

Fig. 4. Ammonia Removal rate and albumin secretion rate of hepatocyte               spheroids cultured as suspension, collagen-gel beads.

배양 초기부터 암모니아 제거능이 감소하고, 알부민은 4일째부터 급격히 감소함을 볼 수 있으며, collagen bead에 고정한 경우 암모니아 제거능은 초기 7일까지 증가하며, 알부민 분비능은 12일 까지도 초기 분비능이 거의 유지됨을 알 수 있다. 또한 같은 collagen bead의 경우라도 높은 농도로 세포를 접종한 것이 훨씬 높은 암모니아 제거능과 알부민 분비능을 보이는데. 이는 간특이 기능에 있어 세포와 세포의 상호작용, 세포와 기질의 상호작용이 일반적으로 간 특이 기능에 가장 중요한 요소로 인식되어 왔으나, 그에 못지 않게 세포에 의해 분비되는 ECM이나 대사물이 인접한 구상체에 미치는 영향 또한 중요한 변수로 고려해야 할 것이다.

참고 문헌

1. A.P.Li. and Dale, J.B.: "A simplified method for the culturing of primary       adult rat and human hepatocytes as multicellular spheroids", In Vitro Cell.     Dev. Biol., 28A, 673-677(1992)

2. 이재호, 박정극, 최태부,: □세포형태에 따른 쥐간세포의 분화기능□, 한국생물공     학회지 제7권 제4호 278-283(1992)

3. Yuji, N., Tokusashi, Y., Kadohama, T., Nishimori H. and Ogawa K.:           "Hepatocytic Cells Form Bile duct-like structures within a                    three-dimensionsal collagen gel matrix", Experimental Cell Research, 223,      357-371(1996)

4. S.P. Kim, D.H. Lee and J.K. Park: "Development of hepatocyte spheroids       immobilization technique using alternative encapsulation method",              Biotechnol. Bioprocess Eng. 3, 96-102(1998)

5. Seglen P.O.: "Preparation of Isolated Rat Liver Cells", Meth. Cell. Biol.,        13. 29-83(1975)

6. 이두훈, 류재남, 양은경, 정미경, 박순희, 박정극: □교반 용기를 이용한 쥐 일차    간세포의 구상체 배양□, 한국생물공학회지,  12(4), 449-455(1997)

7. Avi Rotem, Mehmet Toner, Sangeeta Bhatia, Brent D. Foy, and Ronald G.:     "Oxygen is a factor determining in vitro tissue assembly: Effects on          attachment and spreading of hepatocytes", Biotechnology and                 Bioengineering, 43, 654-660(1994)