글루코스 측정 생물센서를 이용한 Cellulose Acetate Membrane의 포도당 확산계수 농도 의존성 연구

정태훈*, 홍석인**, 김태진↕

수원대학교 화학공학과, (주)KLK 중앙 연구소*, 고려대학교 화학공학과**

A Study on Concentration Dependency of Glucose Diffusivity

in Cellulose Acetate Membrane by Glucose Biosensor

Tae-Hoon Jurng*, Suk-In Hong**, Tai-Jin Kim↕

Dept. of Chemical Engineering, University of Suwon

*R&D Institute, KLK Eng. Co., Ltd, Suwon

**Dept. of Chemical Engineering, Korea University

서론

일반적으로 바이오센서는 생물학적 요소에 따라 affinity sensor와 metabolism sensor로 분류할 수 있다[1]. Affinity sensor는 lectin, antibody, receptor 등을 이용하며, analyte가 결합(binding)하여 생긴 변화를 transducer로 감지한다. Metabolism sensor는 효소, 세포내의 소기관, 미생물 혹은 조직(tissue)의 촉매 반응으로 변화하는 전기화학적 활성 물질, 열, 빛 등을 이용하기 때문에 catalytic sensor라 부르기도 한다[2]. 이들 다양한 바이오센서에서 분석 대상체의 전달과 반응은 항상 동시에 발생하며 평형에 도달하는 속도는 응답시간을 결정한다. 바이오센서의 이러한 특성은 고정화된 생물학적 요소와 사용되는 matrix의 물성에 의존한다. 즉, 고정화 효소의 active site가 가려져서는 안되며, 고정화 층 내부에서 기질과 생성물의 물질 전달이 용이해야 한다. 또한 효소 반응이 충분히 진행한 후에도 효소의 안정성이 보장되어야 한다. 본 연구에서는 센서 내부에서의 물질 전달 현상과 효소에 의한 반응의 상관 관계를 규명하기 위하여, cellulose triacetate(CTA) membrane과 glucose oxidase(GOD)로 구성된 글루코스센서를 이용하여, 바이오센서 내부에서의 글루코스의 전달과 반응을 연구하였다. 본 연구의 세부적 목적은 Clark oxygen electrode를 이용하여 GOD 고정화 층을 보호하기 위하여 사용된 글루코스 센서의 dialysis membrane으로 사용되는 cellulose acetate(CA) membrane을 통과하는 글루코스의 확산계수를 규명하고자 하였다.

이론

글루코스 전극은 일반적으로 polarographic type 용존산소 전극을 transducer로 사용하는데, 이는 금 또는 백금을 음극(cathode)으로 하고 Ag/AgCl을 양극으로하여 -0.6 ∼ -0.8 V의 일정한 전위를 가해주면 용존산소가 음극표면에서 다음과 같이 전기화학적으로 반응하는 것을 이용하여 소모된 산소의 양을 측정할 수 있기 때문이다[3].

Cathodic reaction : O2 + 2H2O + 2e-          H2O2 + 2OH-	(1)

H2O2 + 2e-             2OH-	(2)

Anodic reaction : 4Ag + 4Cl-         4AgCl + 4e-	(3)

Overall reaction : 4Ag + O2 + 2H2O + 4Cl-         4AgCl + 4OH-	(4)

GOD가 고정화되어 있는 막에서는 식 (5)과 같은 효소촉매 반응으로 산소가 소모되므로 기질의 양, 즉 글루코스의 농도에 비례하는 전기적 신호를 얻을 수 있다.

GOD

Glucose + O2                 Gluconic acid + H2O2	(5)

효소반응 결과 소모된 산소량은 소모되는 글루코스의 양과 화학양론적으로 일치하므로 산소량의 변화에 따른 전류의 변화는 글루코스의 시간에 따른 membrane 투과량과 일치한다.  따라서 글루코스 농도에 따른 전류의 변화를 이용하여 글루코스의 확산계수를 구할 수 있다. 글루코스의 농도가 unit step으로 변화했을 때 전류의 변화를 이용하여 식(6)에서 다음과 같이 포도당 확산계수(Dg)를 구할 수 있다. 이때 C는 글루코스의 농도이다.

[eqn: {partial C} over{ partial t}``=``{D sub g} {{partial sup 2} C} over {{partial x} sup 2}]	(6)

I.C.	C = 0  at  t = 0	(7)

B.C.1	C = 0  at  x = 0	(8)

B.C.2	C = Po at  x = dm	(9)

이 편미분 방정식의 해는 다음과 같이 알려져 있다[4].

[eqn: {C over C sub o} = {x over d sub m} + □ atop { sum } atop {n=1} 2 over n□ (-1) sup 2 sin{n□x over d sub m} exp (- n sup 2 □ sup 2 D sub g t / {d sub m} sup 2 )}]              (10)

글루코스 센서에서의 전류는 음극표면의 산소 flux에 다음과 같이 비례한다[5].

[eqn: I = nFAD sub g ( {partial C} over{ partial x }) sub {x=0}]                              (11)

식 (10)를 미분하여 식 (11)에 대입하면 시간에 따른 전류의 변화 It는 다음과 같이 유도된다.

[eqn: I sub t = nFA({D sub g} over {d sub m}) C sub o {[1 + 2 □ atop { sum } atop {n=1} (-1) sup 2 exp (- n sup 2 □ sup 2 D sub g t / d sub m sup 2 ) ]}]

[eqn: = I sub s ```[1 + 2 □ atop { sum } atop {n=1} (-1) sup 2 exp (- n sup 2 □ sup 2 D sub g t / d sub m sup 2 ) ]}]	(12)

이때 Is는 안정상태에서의 일정한 전류값이다. 따라서 식 (12)를 이용하여 글루코스의 확산계수(Dg)를 구할 수 있다.

실험

전극을 일정한 온도가 유지되는 100ml 항온조에 설치하였으며 음극과 양극간의 전위차를 유지시켜주기 위하여 potentiostat(지상기전 P-100)을 사용하였다. 이때 reference electrode 단자와 auxiliary electrode 단자를 함께 양극에 연결하고 working electrode 단자를 음극에 연결하였다. Potentiostat와 IBM PC/AT에 내장된 data aquisition card(PCL-812PG, Advanetec Co.)를 이용하여 interface하였고 Turbo C로 매초 마다 전류를 자동적으로 기록하도록 프로그램 하였다.  음극의 전위를 -0.8V로 고정한 조건에서 각 산소분압에서 정상상태의 전류를 기록하였다. 음극은 직경 4mm의 금 disk 형태로 가공하여 아크릴 튜브에 에폭시로 고정하여 제작하였다. 고정된 음극은 사포 No. 6000으로 연마하였다. 전극의 내부 전해질은 1 M KCl을 사용하였다. Glucose oxidase(EC 1.1.3.4)와 1,1'-carbonyl diimidazole (CDI)은 Sigma제품을 사용하였다. 효소의 고정화는 1M NaOH를 사용하여 CTA막의 한 면을 가수분해하고 CDI를 녹인 용액으로 membrane의 hydroxyl group을 activation시킨 후 GOD를 coupling하였다. 고정화 반응 후에는 0.05M의 Tris-HCl buffer(pH 7.2)로 CTA membrane을 단순 세척하여 미고정화 효소를 제거한 다음 0.05M sodium phosphate buffer(pH 6.0,  4 oC)에 보관하며 사용하였다. Free GOD의 kinetic parameter는 GOD(0.038 unit/mL)를 peroxidase(1 unit/mL)와 □-dianisidine(0.17 □mol/mL)를 함께 pH 6.0의 Na-phosphate buffer에서 반응시켜 5분 후의 흡광도 변화를 436nm에서 측정하여 구하였다. 각각 다른 양의 GOD가 고정화된 CTA membrane을 전극에 부착한 후 glucose를 투입시 전극에 흐르는 전류 변화를 기록하였다. CA는 효소가 고정화된 CTA membrane을 보호하고 글루코스와 산소를 통과시키는 반투성 막이다. 글루코스의 확산도는 시간에 따른 전류의 변화를 정규한 후 Marquardt-Levenberg algorithm을 이용한 비선형 회귀 분석법으로 구하였다. Non-linear regression을 이용할 때는 식(12)의 5차 항까지 취한 후 상용화된 프로그램(Origin 5.0)을 이용하였다.

결과 및 토론

온도(25oC)와 산소분압이 일정하게 유지되는 항온조에 전극을 설치한 후 전극에 분극전압 - 0.8V(vs. Ag/AgCl)을 가하면 공기의 산소분압에 해당하는 초기 안정 전류가 흐른다. 이때 포도당을 투입하면 전극 내부의 산소가 효소 반응에 의하여 소모되면서 전류가 감소하기 시작하고, 일정한 시간이 흐른 후에 안정된 전류를 나타낸다. Fig. 1에 나타난 바와 같이 계산된 글루코스의 확산계수는 글루코스의 농도 및 고정화 효소양에 따른 의존성을 나타내었다. 이에 따른 보완 연구를 수행 중이다.

Fig. 1. Concentration dependency of glucose diffusivity of cellulose

acetate on various glucose level.

감사의 글

본 연구는 산업자원부의 1999년도 산업기반기술개발사업(993-76-04)으로 수행되었으며 연구비 지원에 감사드립니다.

참고 문헌

1. Plamen, A. and Wilkins, E., Biotechnology and Bioengineering, 43,            262(1994).

2. Riedel, K., Renneberg, R., Wollenberger, U., Kaiser, G. and Scheller, F. W.,     J. Chem..Tech.. Bitechnol., 44, 85(1989)

3. Kim, T.J., Korean J. Biotechnol. Bioeng. 4, 150(1989).

4. Crank, J.: "The mathmatics of diffusion", Clarendon Press, Oxford, 1975.

5. Jurng, T. H., Hong, S. I. and Kim, T. J., HWAHAK KONGHAK, 34,         489(1996).