양이온성 microspheres와 음이온성 microspheres의 단백질 흡착과

Latex Agglutination Test 에 관한 연구

이가영, 최성욱, 방시원, 윤정열*, 김중현, 김우식

연세대학교 공과대학 화학공학과, *Biomedical Engineering IDP, University of California, Los Angeles

Study of protein adsorption and latex agglutination test between

cationic and anionic microspheres

Ga-Young Lee, Sung-Wook Choi, Shi-Won Pang, Jeong-Yeol Yoon*,

Jung-Hyun Kim, Woo-Sik Kim

Dept. of Chemical Engineering, College of Engineering, Yonsei Univ. *Biomedical Engineering IDP, University of California, Los Angeles

서론

오늘날 고분자 공학의 발전과 더불어 생물 공학의 기술 또한 급속한 진전을 보이고 있다. 이에 따라 고분자 공학과 생물 공학의 접합 연구가 활발히 진행되고 있고 이들을 이용한 biomedical 분야에서의 functional polymeric microsphe- res는 0.1에서 수 □의 직경을 가지는 fine polymer particles로서 solid-phase immunoassay, affinity bioseparation, immunomagnetic cell separation 등에 광범위하게 응용되고 있다. microspheres의 실제적 응용에 있어서는 antigen-anti -body, DNA-complimentary DNA (또는 RNA), DNA-DNA binding protein 등과 같은 affinity bioligand를 입자 표면에 부착하여 selectivity와 detection sensi- tivity를 향상시킨다. 이에 본 연구에서는 styrene을 주단량체로 하여 amino group을 modified한 양이온성 particles (PS/PDMAM)와 carboxyl group을 modified한 음이온성 partilces(PS/PMAA)를 제조하여 model 단백질인 동시에 항원으로서 BSA를 택하여 각각의 particles에 대한 흡착 거동을 비교하였다. 또한 anti-BSA 용액과 반응시켜 LAT(latex agglutination test)에 의한 면역 검출 거동을 비교, 고찰하였다.

이론

Latex immunoassay는 항원-항체 반응을 이용하여 biomaterials를 검출, 정량화하는 방법으로 in vitro 진단법에 기초하여 전염성 질병의 진단에서부터 여러 가지 단백질, 약(drug), 호르몬의 검출에까지 광범위하게 응용되고 있으며 크게 RIA, ELISA, FIA, LAT의 4가지로 분류할 수 있다. LAT는 blood serum, urine, cerebrospinal fluid에서의 항원 또는 항체에 대한 미세 존재량을 검출하는데 효과적이며 특별한 성질을 갖는 미세한 고분자 입자가 액상에 부유 상태로 존재할 때 개개 입자의 표면에 단백질 부분과의 hydrophobic interaction을 위하여 antibody 또는 다른 단백질로 균일하게 코팅한 후 antigen이 포함된 sample과 혼합시켰을 때 항원-항체 반응으로 형성된 복합체가 충분히 cross-linking되면 가시적인 침전이 발생하게 되는데 이와 같은 라텍스 입자의 응집 현상을 이용하여 biomaterials를 검출, 정량화하는 방법으로써 다른 IA에 비하여 상당히 많은 장점을 가지고 있다. LAT는 radioisotope, enzyme, fluoroescer등이 필요없고 검출 감도가 높으며 원심분리나 막 분리를 통한 비반응성 물질의 분리가 용이하다. 다양한 검출 방법 중에서는 turbidimetric detection이 가장 간단하면서 신속한 방법으로 통용되고 있으며 이는 spectrophotometer의 turbidity 변화를 직접적으로 측정함으로써 도출할 수 있다.(Fig.1) 일반적인 흡착은 활성점과 흡착제의 1:1 결합으로 이루어지므로 이에 대한 속도식 및 흡착 평형 조건에서의 Langmuir 흡착등온선을 도출하기가 용이하지만  monodisperse latex particles에 대한 단백질의 흡착은 이처럼 단순하지 않다. 단백질은 거대분자이므로 활성점과 1:1 결합을 이루지 않고 그 결합에도 여러 상호 작용력들이 동시에 작용하며 이러한 결합력 사이에서도 인력과 척력이 함께 존재할 뿐만 아니라 액상의 pH, 이온강도, 전해질 종류, 단백질의 종류와 농도, 고분자 물질의 종류와 입자 크기, 고형량 농도 등 여러 인자들의 영향을 받기 때문이다. 단백질의 흡착에 관련된 상호작용력 중 소수성 상호작용력은 가장 주된 작용력으로 기본적으로 엔트로피 상호작용력이며 일반적으로 단백질은 styrene등의 단량체들이 제공하는 소수성 표면에 더 많이 흡착되고 등전점 부근에서 최대로 흡착된다. 정전기적 상호작용력은 KPS와 같은 개시제로부터 생성된 sulfate기와 acrylic acid(AA)나 methacylic acid(MAA)등의 친수성 공단량체에서 생성된 carboxyl기 등 표면의 음이온성 기능기로 인한 negatively charged microspheres와 dimethylaminoethyl methacrylate (DMAM),

DSDM 등의 공단량체에서 생성된 amino기 등 양이온성 기능성기를 가지는 posi

-tively charged microspheres의 표면 전하와 pH에 따라 변화하는 단백질의 전하 사이에 발생하는 인력 또는 척력에 의한 상호작용이다.(Fig.2) 이 외에도 수소 결합력이 존재하며 이 중 가장 흔한 것은 hydroxyl-carbonyl, amide-carbonyl 수소 결합이고 그 다음으로 중요한 것이 hydroxyl-hydroxyl, amide-hydroxyl 수소 결합이다. 또한 van der Waals interaction이 있으나 이 작용력은 소수성 작용력 등의 엔트로피 상호 작용력에 비해 무시할 수 있을 만큼 작다고 알려져 있다.

Fig 2.  Overall Schematic representation of the protein adsorption on the carboxylated microspheres

Fig.1 Latex agglutination

실험

Styrene(S), methacrylic acid(MAA)는 일본의 Junsei Chemica Co., Dimethyl aminoethyl methacrylate(DMAM)는 미국의 Sigma Chemical Co.에서 구입하였으며 Junsei의 단량체는 inhibitor 제거 컬럼(Aldrich Chem. Co., USA, catalog No. 306312)에 통과시켜 정제하였다. Potassium persulfate(KPS, Samchun pure che- mical Ind., Ltd., Korea)를 음이온성 개시제로, V-50(Azo-bis(isobuthylamidin e hydrochloride), Sigma Chemical Co.)를 양이온성 개시제로써 하였으며 1:1 mixed bed 이온교환수지(Dowex MR-3, Sigma Chemical Co., USA, Catalog No. I-9005)로 합성된 microspheres를 정제하였다. Bovine serum albumin(BSA,Sigma Chemical Co., catalog No. A-7906)을 antigen으로, Anti-bovine serum albumin (anti-BSA, Sigma Chemical Co., catalog No. B-7276)을 antibody로 실험하였으며 anti-BSA는 토끼에서 추출된 polyclonal, fractionated antiserum이다. (anti-BSA는 증류수에 용해시켜 사용하였다.) 물은 Elgastat의 UHQ system(UK)로 증류한 DDI(Distilled and deionized) water를 사용하였다. 본 연구에서는 두 종류의 microspheres를 제조하여 실험하였으며 음이온성 particles로써 PS/ PMAA를, 양이온성 particles로써 PS/PDMAM을 택하였다. 모두 batch-type emu lsifier-free emulsion copolymerization으로 중합했고 주단량체와 공단량체의 중합비(wt%기준)는 99.9:0.1로 하였다. 제조한 입자들은 이온 교환수지로 정제하고 stirred cell (Amicon Model 8400, USA)에서 막(Omege series, Filtron Tech- nology Co., USA)에 통과시키는 serum replacement method로 다시 정제한 후 특성분석을 하였다. CHDF(capillary hydrodynamic fractionation, CHDF-1100, Matec Appiied Sciences, USA)로 입자들의 평균직경을, SEM으로써 분산도를 측정한 후 전도도 적정으로 입자표면의 기능성기의 양을 정의하였다. 특성분석이 끝난 입자들은 side-on mode로 BSA를 표면에 coupling하는데 25℃의 shaking water bath에서 batch adsorption에 의하여 음이온성 particles은 BSA의 등전점에서 약간 acidic한 pH 4.5, 양이온성 particles은 약간 basic한 pH 5.0에서 3시간 교반하였고 사용된 buffer는 sodium acetate와 아세트산(Yakuri Pure Chemicals Co., Ltd. ,Japan)으로 이온강도는 0.01로 동일하게 제조하였다. 이러한 BSA- coupled microspheres을 동일장치에서 anti-BSA 용액과 혼합하여 agglutination 정도를 UV(Shimadzu UV-160A, Japan)를 통해 turbidity 변화를 분석하였다.

결과 및 토론

본 실험은 회분식 무유화제 공중합법으로 제조한 양이온성 mocrospheres(PS/ PDMAM)와 음이온성 microspheres(PS/PMAA)의 표면에 항원(BSA)을 코팅한 후 항체(anti-BSA)와 반응시켜 항원-항체 반응에서의 응집을 통해 발생하는 흡광도의 변화를 측정하는 LAT법을 사용하여 항체를 정량하고 검출 감도를 고찰하였다. 실험에 사용된 PS/PMAA는 카르복실기를 가지고 있어 음전하를 띠며 평균 직경은 605.3nm이고 Nc(Number density of surface carboxyl group)은 2.1015 /nm2이고 PS/PDMAM은 아미노기를 가지고 있어 양전하를 띠며 평균 직경은 864.1nm, Nc는 2.8063/nm2으로 PS/PDMAM의 입자 크기 및 표면 전하 밀도가 더욱 크게 나타났다. 이를 다음 표(Table.1)에 나타내었다.

Table 1. characterization results of cationic and anionic microsoheres

	PS/PMAA(0.1 wt%)	PS/PDMAM(0.1wt%)
avg. particle diameter	605.3 nm	864.1 nm
surface end group	2.1015 (/nm2)	2.8063 (/nm2)
surface charge density	336.70 (/cm2)	449.62 (/cm2)

Fig. 3.에서 보듯이 PS/PMAA는 약 1.4mg/ml의 BSA 농도에서 흡착 평형에 도달하며 Langmuir-Freundlich 흡착 등온식을 만족한다. 이에 비해 PS/PDMAM은

등온식에서 약간 벗어난 형상으로 BSA 농도가 1.6mg/ml의 농도 범위까지의 흡착량이 상대적으로 현저히 낮았다. LAT법에 의한 검출 감도를 비교해보면 PS/ PMAA의 초기 검출 감도가 PS/PDMAM에 비하여 상당히 민감함을 알 수 있었으며 이는 PS/PMAA의 표면이 상대적으로 소수성이 크고 표면 전하 밀도가 낮아 정전기적 상호작용력의 영향을 작게 받으므로 단백질과의 결합력이 증가함에 따른 것으로 보인다. 이 때 입자 크기의 영향을 최소화하기 위하여 각 입자들의 표면적은 0.19m2/ml로 고정하여 실험하였으므로 이의 영향은 무시할 수 있다.

참고문헌

1. J.-Y. Yoon, Ph.D. thesis. Yonsei University, Seoul (1998)

2. J.-Y. Yoon, H.-Y. Park, J.-H. Kim and W.-S. Kim, J. Colloid Interface Sci.

177, 613 (1996).

3. Y.-J. Park, J.-Y. Yoon, H.-Y. Park, J.-H. Kim and W.-S. Kim, J. Biomed. Eng.

Res. 14, 209 (1993)

5. J.-Y. Yoon, J.-H. Kim and W.-S. Kim, Colloids Surf. B 12, 15 (1998)

6. J.-Y. Yoon, J.-H. Kim and W.-S. Kim, Colloids Surf. A 153, 415 (1999)

7. L.B. Bangs, Pure Appl. Chem. 68, 1873 (1996)