Paracoccus denitrificans의 permeabilization 특성

황심연, 이상호, 송주영

국립창원대학교 공업화학과

Characteristics of permeabilized Paracoccus denitrificans

Hwang Sim-Yeon, Lee Sang-Ho, Song Ju-Yeong

Department of Chemical Technology, Changwon National University

서론

지금까지 세균을 이용해 환경 문제를 해결하려는 시도와 노력이 많이 진행되어 왔다. 하지만 살아 있는 미생물을 이용해 실제 공정에 사용하는 것은 여러 가지 제약이 따라 왔다. 미생물이 외부의 환경변화에 따라 죽을 수도 있고, 활성을 잃어버릴 수도 있기 때문이다. 그래서 미생물에서 적절하게 효소를 뽑아내서 이것을 이용하려는 방법들이 고안되기 시작했다. 효소를 정제하는데 많은 시간적, 경제적인 문제가 발생되는 반면 효소를 이용했을 때 빠른 시간에 평형에 도달한다.

permeabilization은 물리적 또는 화학적인 방법을 사용하여 세포막을 손상시켜 물질이 세포막을 통과시키기 원활하게 하는 방법이다. 물질이 원활하게 출입하면서 세포내의 효소를 쉽게 이용하여 빠른 처리시간을 얻을 수 있다.

이 실험에서는 유기용매인 toluene을 각각 1, 5, 10, 20v/v%의 농도로 수세된 균주 Paracoccus denitrificans에 넣고, permeabilization시켜  유기용매의 농도변화에 따른 permeabilization 특성을 알아보았고, permeabilization된 P. denitrificans를 배양액에서 배양시켜서 균주의 성장곡선을 그려보았다.

이론

세포막의 주된 성분은 인지질이며, 인지질의 물리적 특성은 한 분자가 친수성 부분과 소수성 부분을 동시에 가지는 amphipathic molecule이다.1) 소수성 부분을 유기 용매에 녹여 세포막을 손상시키는 방법이나 계면활성제를 사용하는 방법이  화학적 permeabilization이고, 약 10000rpm이상의 속도로 원심분리시 전단응력에 의해 손상시키거나, 순간적으로 얼렸다 녹였다를 반복시키면서 손상시키는 방법이 물리적인 방법이다.2) 손상된 부분에 의해 세포막이 얇아지며, 이런 현상으로 인해 물질의 출입 저항이 줄어든다.3) 즉, 투과성이 좋아지는 것이다.

실험

Incubater에서 30℃, 230rpm의 환경에서 3일 동안 성장된 P.denitrificans를 2회에  걸쳐 2000rpm 속도로 원심분리하고, 멸균된 buffer solution(pH=7.4)으로 수세하였다. 수세한 P.denitrificans에 유기용제인 toluene을 1, 5, 10, 20v/v%의 농도로 각각 주입시키고, 500rpm의 속도로 shaking시켜 permeabilization 시켰다.

permeabilization정도는 permeabilized P.denitrificans를 2000rpm의 속도로 원심분리시킨 뒤 상층액을 뽑아내 Lowry의 단백질 정량법으로 UV-VIS spectrophotometer를 사용하여 750nm에서 흡광도를 측정하여 알아내었다.

또, 5% toluene으로 30초, 1분, 10분 처리된 균주와 처리되지 않은 균주를 각각 배양시켜 UV-VIS를 사용하여 600nm에서 optical density를 측정하여 각각의 생장곡선을 그려봄으로서 permeabilization에 의해 균주의 생사여부와 성장특성을 알아 보았다.

결과

Figure.1에서 Figure.4는 톨루엔의 농도를 달리해서 처리하였을 때 흡광도를 나타낸 그래프다.

Figure.1은 1% 톨루엔으로 처리하였을 때 단백질이 가장 많이 녹아 가장 높은 흡광도를 보이는 시간이 대략 10분 정도임을 알 수 있다.

Figure.2. Absorbance of permeabiliz          -ed cells by 5v/v% toluene.

Figure.1. Absorbance of permeabiliz

-ed cells by 1v/v% toluene.

Figure.2 는 5% 톨루엔으로 처리하였을 때 단백질이 가장 많이 녹아 나오는 시간이 대략 1분 정도이며, 1% 톨루엔으로 처리했을 때에 비해 높은 흡광도를 보이는 시간이 짧아짐을 알 수 있다.

Figure.3는 10% 톨루엔으로 처리하였을 때  단백질이 가장 많이 녹아 나오는 시간이 대략 30초 정도이다

Figure.3. Absorbance of permeabiliz

-ed cells by 10v/v% toluene.

Figure.4. Absorbance of permeabiliz           -ed cells by 20v/v% toluene.

Figure.4는 20% 톨루엔으로 처리하였을 때  단백질이 가장 많이 녹아 나오는 시간이 대략 20초 이내에서 높은 흡광도를 볼 수 있다.

톨루엔의 농도가 높아질수록 단백질이 가장 많이 녹아 나오는 시간이 계속 짧아 진다.  처리하는데 일정시간이 지나면 흡광도는 감소된다.

Figure.5. Comparison of growth rate by free and permeabilized cells.

Figure.5는 5% 톨루엔으로 처리하였을 때 처리하지 않은 균주와 처리한 균주의 성장곡선을 그려보았다.

톨루엔으로 처리하였을 때 균주는 성장곡선으로 보아 균주는 생존하고 있음을 알 수 있다. 무처리시 균주에 비해 톨루엔으로 처리하였을 때 약간의 순응기간이 더 오래 걸리지만 일정시간 이후에는 무처리 균주와 비슷하게 성장을 하는 것을 볼 수 있다. 30초와 1분 처리한 균주는 성장하는 패턴이 비슷하고, 10분의 처리시간을 거친 균주는 전체적으로 느리게 성장하는 것을 알 수 있다.

참고문헌

1. 김 두식, □세포막의 구조적 특성□,생화학 총설집(1988) II권 p.187-197

2. Ferix H., "permeabilized cells", Analytical biochemistry, 120, p.211-234(1982)

3. 정 수배, □오수로부터 고정화된 permeabilized 균주를 이용한 암모니아 제거에     관한 연구□, 창원대 공업화학과 석사학위논문집(1998)