친·소수성 고분자 수식에 의한 Trichoderma viride

셀룰라아제의 셀룰로오소로의 흡착 특성

한지윤, 박귀남, 박진원, 梶內俊夫*

연세대학교 화학공학과, 동경공업대학교 국제개발공학과

Adsorption characteristics of Trichoderma viride cellulase on cellulose by modification with a hydrophilic/hydrophobic copolymer

Han, J.Y., Park, K.N., Park, J.W., and Kajiuchi Toshio*

Department of Chemical Engineering, Yonsei University, Korea

and Department of International Development Engineering,

Tokyo Institute Technology, Japan*

서론

셀룰로오스의 가수분해 공정은 폐셀룰로오스계 물질의 재활용과 화석연료의 대체물질개발의 측면에서 최근 주목받고 있다. 효소를 이용한 당화공정은 산 당화 공정에 비하여 에너지 절감, 온화한 조건의 온도, 압력에서 반응이 일어나는 장점이 있다. 최근 높은 활성의 효소가 개발되면서 그에 관한 연구가 활발히 진행되고 있으나, 섬유질 바이오매스인 셀룰로오스의 효소 가수분해 공정은 효소-기질 반응에 의한 당생성속도가 느린 점과 효소-기질과의 흡착에 의한 효소 실활이 급속히 진행된다는 점 등과 같은 반응공학적인 문제와 아직까지 가수분해효소의 생산가격이 비싼 경제적인 문제가 있다. 효소의 반응성을 높이기 위한 방법으로 기질 전처리나 첨가제 사용, 효소의 고정화 등이 연구되고 있다.

본 연구에서는 셀룰라아제의 반응성 향상을 통한 전환율 향상 및 반응 후의 효소 회수 용이성을 위하여 공중합 고분자 수식 셀룰라아제를 제조한 후, 이를 cellulose의 가수분해반응에 적용하여 가수분해 및 흡착 특성을 고찰하였다.

실험재료 및 실험방법

(1) 수식셀룰라아제의 제조

본 실험에서는 국내산 셀룰라아제인 Tricoderma viride cellulase C(태평양(주))를 사용하였다. 셀룰라아제의 활성도는 FPase 활성도로 나타내었는데, 50℃, pH 5.0에서 1분 동안에 1□mol의 생성환원당을 생산하는 효소량을 1Unit로 정의하였다. 표준 당화기질로서는 여과지 FP-5C(Toyo Roshi Ltd. Japan)를 사용하였으며 셀룰라아제의 활성은 391Unit/g이었다. 환원당농도 측정은 dinitro salicylic(DNS) acid 발색법을 사용하였다. 수식을 위한 공중합체는 일본의 Nippon Oil & Fats사의 제품으로 Polyoxyethylene (POE) 유도체와 Maleic Acid Anhydride(MAA)의 공중합체로서 그 구조는 Fig.1과 같다. 수식반응은 셀룰라아제의 아미노기와 MAA이 결합하는 말레일화 반응(maleylation)에 의한 것으로, Kajiuchi & Park의 방법을 사용하여 수식 셀룰라아제를 제조하였다. 수식은 pH 8.0∼8.2, 온도 0∼4℃에서 수식 반응액의 pH값이 불변인 시점을 수식 반응 종결시점으로 하였다. 반응이 진행됨에 따라 H+가 생성되어 pH가 감소하므로 염기(0.3∼0.5N NaOH)에 의한 pH 조절이 필요하다. 각각의 수식셀룰라아제의 아미노기 농도는 trintrobenzene sulfonic acid(TNBS)법으로 측정하였으며 수식률(DM)은 다음과 같이 정의하였다.

(n : ethylene oxide 수,

k : 공중합도)

Fig 1. Characteristics of copolymers.	Fig 2. Maleylation of MAA & Proteinrs.

(2) 당화 반응

당화반응에서는 셀룰라아제와 세 가지의 공중합 고분자를 1:4의 비율로 하여 수식시킨 효소를 사용하였고, □-cellulose(Sigma)를 기질로서 전처리하지 않고 사용하였다. 당화반응장치는 회분식으로 전체 반응액의 부피는 200ml, 효소 농도는 0.1%(w/v), 기질 농도는 1.0%(w/v)로 하였다. 온도를 4℃와 50℃로 변화시키고, 교반속도와 pH는 300rpm, pH 5.0로 고정시켜 실험하였다.

생성된 환원당농도는 DNS 발색법, 효소량은 GPC(Gel Permeation  Chromatography)법을 사용하여 측정하였다. 사용한 column은 TOSOH(Japan)의 TSK-GUARD COLUMN SW(7.5×75), TSK-GEL G3000SW(7.5×300) column으로 구성되어 있고, 용리액(1/15M Na2HPO4와 1/15M KH2PO4로 제조한 pH 7.0의 0.1M 인산 완충용액)의 유속은 0.8□/min, 검출기(UV) 파장은 280nm이며 온도는 조절하지 않았다.

결과 및 고찰

(1) 수식셀룰라아제의 수식률 및 활성

AKM 1511, AIM 1520, ACM 1611의 세 가지 공중합 고분자/셀룰라아제의 질량비를 1∼4 까지 변화시키면서 수식반응을 시킨 결과, 질량비 4에서 공중합 고분자의 종류에 관계없이 최대 수식률의 수식 셀룰라아제가 얻어졌으며 최대 수식률은 고분자에 따라 차이가 있으나 거의 35∼55 %를 나타내었다. 한편 잔존 활성은 수식율이 증가할수록 서서히 감소하였으나, 항상 75 % 이상의 잔존 활성을 보존하였다(Fig. 3).

	AKM 1511	AIM 1520	ACM 1611
EO/(AO) [wt%]	100	75	20
n	33	30	29
k	10	22	10
M.W.	16000	35000	18000

Fig 3. Degree of modification and relative activity vs. weight ratio of copolymer modifier to cellulase.	Table 1. Characteristics of Copolymers(EO:ethylene oxide, PO:propylene oxide, AO:EO+PO).

(2) 수식 셀룰라아제의 당화반응

당화가 잘 일어나는 온도인 50℃에서 가수분해 반응을 시켰다. 수식 셀룰라아제의 전환율은 반응 초기에는 미수식 셀룰라아제보다 낮으나, 서서히 증가하여 18시간에서의 전환율은 AKM, AIM 수식 셀룰라아제의 경우 미수식 셀룰라아제보다 높았다.

이때의 유리효소량을 분석한 결과, 효소는 반응 10분 이내에 기질에 흡착된 후 반응시간이 경과함에 따라 흡·탈착을 반복하는 경향을 보였다. 18시간에서의 유리효소량은 미수식 셀룰라아제가 가장 적었으며 AKM, ACM, AIM 수식 셀룰라아제의 순이었다. ACM의 경우는 초기의 흡착양 자체가 적었고, 반응 시간 동안

Fig. 4(a) Conversion vs. reaction time at 50℃.	Fig. 4(b) Relative free enzyme concentration vs. reaction time at 50℃.

40∼60% 정도를 유지하였다. 그 결과 전환율도 다른 효소보다 낮았는데, 이는 소수성을 띠는 PO(Propylene Oxide)의 영향(ACM의 경우 EO가 25%, PO가 75%)인 것으로 사료된다. 한편, 미수식 셀룰라아제의 경우, 초기에 흡착된 효소가 거의 탈착되지 않고 계속 기질에 흡착되어 있는 것으로 나타났다(Fig. 4).

효소 당화반응 생성물의 방해가 없는 경우의 효소 흡착 거동을 살펴보기 위하여 당화가 거의 일어나지 않는 4℃에서의 당화실험을 하였다. 50℃와 같은 반응 조건에서 짧은 반응 시간인 1시간 동안의 반응을 살펴본 결과, 전환율은 3% 미만으로 매우 낮았고, 상대 유리 효소량은 10분 이내에 급히 감소한 후 일정 수준을 유지 또는 약간 증가하였다. 특히, AKM 1511 수식 셀룰라아제의 경우는 10분 이내에 10% 이하로 기질에 급속히 흡착하고 1시간 후에는 50% 정도까지 탈착되었다(Fig. 5).

Fig. 5(a) Conversion vs. reaction time at 4℃.	Fig. 5(b) Relative free enzyme concentration vs. reaction time at 4℃.

이상의 결과에서 친수성을 가지는 EO(Ethylene Oxide)의 수가 증가함에 따라 효소-기질 간의 초기 10분 간의 흡착량이 증가하며, 일정 반응 시간 후의 효소 탈착량도 증가함을 알 수 있다.  또한, 반응 후 효소 회수에 있어서 수식 셀룰라아제의 경우가 미수식 셀룰라아제보다 유리할 것으로 생각된다.

References

1. Steiner, W., Sattler, W., Esterbauer, H. 1988. Adsorption of Tricoderma reeser cellulase on cellulose : Experimental data and theri analysis by different equations. Biotechnology and bioengineering. 32: 853-865.

2. Park, J. W. and Kajiuchi, T. 1995. Development of effective modified cellulase for cellulose hydrolysis process. Biotechnology and bioengineering. 45: 366-373.

3. William, E. K., Mark, T. H. 1998. Benefits from tween during enzymatic hydrolysis of corn stover. Biotechnology and bioengineering. 59(4): 420-427.