재조합 대장균에 의한 환경 독성물질 TBT의 Bioassay

차재민, 김종연, 이준철, 김병우

성균관대학교 화학공학과

Bioassay of an Environmental Toxic TBT using a Genetically Recombinant E.coli

Jae Min Ch'a, Jong Yeon Kim, Jun Chul Lee, Byung Woo Kim

Dept. of Chem. Eng., Sungkyunkwan Univ.

서론

TBT(tributyltin)를 비롯한 유기 주석화합물은 PVC 안정제, 각종 플라스틱 첨가제, 산업용 촉매, 살충제, 살균제, 목재보존제 등으로 널리 사용되고 있다. 특히 선박용 페인트 내 부착방지제(antifoulant)로 첨가하고 있으며 이 도료를 방오 페인트(antifouling paint)라고 한다. TBT는 선박뿐만이 아니라 해양구조물이나 어망, 어구 등에 부착생물이 달라붙지 못하도록 사용되어 왔으나 독성 때문에 많은 국가들은 현재 사용을 금지하고 있는 실정이다. 이러한 유기 주석은 물, 침전물, 생물체 조직, 슬러지 등 다양한 환경시료에서 검출되고 있고 특히 TBT (TriButylTin)와 TPhT (TriPhenylTin)은 매우 독성이 강해 미국 환경보호청(EPA)에서 규제하는 내분비계 교란물질로 규제가 확정된 환경호르몬이다. 이런 유기 주석 중에서 TBT가 가장 독성이 강한 것으로 알려져 있는데, 피발하는 임포섹스(imposex) 현상을 일으킨다.

유기 주석화합물의 독성은 유기그룹(organic group)의 개수 및 성질과 관계가 크다. 특히 유기그룹이 세 개(triorganotin)일 때 독성이 크며 그 중에서도 tributyltin (TBT)이 가장 독성이 강한 것으로 알려져 있다.

이런 오염물질들의 중화 및 처리기술의 개발도 중요하지만 이들을 손쉽게 검출할 수 있는 방법의 개발 또한 중요하다고 할 수 있다. 현재 환경 오염물질 검출을 위해서 두가지의 접근법이 시도되고 있는데 하나는 특정한 오염물질을 검출하는 직접적인 분석법이고, 다른 하나는 생물체에 대한 해로운 효과를 측정하는 bioassay (biomonitoring system) 방법이다. TBT, TPhT도 직접적인 방법으로 분석이 가능하지만 측정된 양이 얼마나 생물체에 영향을 주는지는 알 수가 해례를 살펴보면 복조류(gastropod)에서는 암컷에 숫컷의 생식기가 생김으로써 불임을 유없다. 따라서 생물체를 매체로 한 sensor가 필요하다.

이론

대부분의 bacteria에는 외부로부터의 열충격, DNA damage, 중금속, 방사능(5) 등의 충격이 가해져도 특정 유전자적 시스템에 의해 새로운 환경에 적응하며 살아갈 수가 있다. 특히 DNA damage가 있을 경우 SOS 레귤론 시스템이란 반응 시스템에 의해 복구되어 살아가게 된다. 이 SOS 레귤론 시스템에서 있어서 LexA protein은 SOS 반응을 억제하는 억제자로서의 역할을 수행하는데 DNA damage나 복제저해가 일어나면 RecA와 같은 protease가 형성되어 SOS 반응의 억제자인 LexA protein을 분해한다. 이런 과정에서 SOS 반응에 의한 product가 생성되게 된다. 그리고 외부로부터의 충격이 복구되면 RecA protein의 활성이 떨어지고 LexA protein이 다시 축적되어 SOS gene이 다시 억제된다(2).

위와 같은 DNA damage를 탐지해내는 promoter로 여러 가지가 알려져 있는데 본 실험에서는 recA(1), dinB, dinD(3)를 이용하였고 이들 promoter의 발현정도를 측정하기 위해서 lacZ 유전자를 사용한 재조합 E.coli를 사용하여 실험하였다.

recA는 DNA damage를 탐지하기 위해 가장 많이 알려진 promoter이고  din B, dinD의 기능들은 아직 명확히 밝혀지지는 않았으나 DNA damage에 promoter의 역할을 할 수 있다고 알려져 있다. 그리고 lacZ 유전자는 □-galactosidase를 만드는 유전자로 이 효소를 enzyme assay하여 활성을 측정하였다.

실험

본 실험에서 사용된 균주는 Table 1과 같다.

균주의 배양은 30℃, 37℃에서 ampicillin(Sigma Co.)이 10□l/ml 첨가된 LB 배지에 agar를 첨가한 고형배지에서 배양하였다. 그리고 TBT의 농도별 비교 실험은 2ml의 ampicillin이 첨가된 LB배지에서 10 h 정도 배양한 후 다시 LB배지에 균을 접종하여 shaking incubator에서 150 rpm으로 OD가 0.2∼0.3 정도 될 때가지 배양하고 TBT를 첨가하여 일정시간마다 sample을 채취하여 실험하였다.

□-galactosidase의 enzyme assay는 Miller(4)의 방법에 의해 실행되었는데  □-galactosidase의 활성은 다음의 식으로 계산되었다.

□-galactosidase activity = [eqn: {1000({OD sub 420 - 1.75OD sub 550})} over {t times V times OD sub 600}]

t = reaction time(min)

V= reaction volume(ml)

결과 및 토론

ACV1003은 Fig 1.과 Fig 2.에 나타난 것처럼 순수배양에서도 상당한 □-galactosidase를 만들어냄을 알 수 있다. 본 실험이 □-galactosidase의 activity를 측정함으로써 유해성의 여부를 판단하므로 순수배양에서는 □-galactosidase가 적게 생성되어야 유해성의 여부를 판단하기 쉽다. 하지만 GW1030과 GW1040의 경우처럼 □-galactosidase의 activity가 작을 경우는 actinity의 측정시간이 많이 소요되므로 검출의 신속성이 결여된다고 할 수 있다. 그리고 Table 2의 Response Ratio를 비교해보아도 ACV1003의 성능이 가장 좋다고 판단된다.

Table 1. 본 실험에 사용된 E.coli strains 와 plasmids

Strain	Description	Reference
ACV1003	pRecALac1/RFM443	1
GW1000	recA441 sulA11 □lacU169 thr-1 leu-6 his-4 aargE3 ilv(Ts) galK2 rpsL31	3
GW1030	As for GW1000, but dinB1::Mu d(Ap lac)	3
GW1040	As for GW1000, but dinD1::Mu d(Ap lac)	3
Plasmid
pRS550	Ampr Kanr multiple cloning site upstream of lacZ	1
pRecALac1	As pRS550, but recA'::lacZ	1

참고문헌

1. Amy C. Vollmer, Shimshon Belkin, Dana R. Smulski, Tina K.   Van DYK,    and Robert A. Larossa. Detection of DNA Damage by Use of Escherichia

coli Carrying recA'::lux, uvrA'::lux, alkA'::lux Reorter Plasmids, Applied      and Environmental Microbiology, 63, 2566-2571, 1997.

2. John W. Little. and David W. Mount, The SOS Regulatory System of         Escherichia coli, Cell, 29. 11-22, 1982.

3. Judy Heilig Krueger, Stephen J. Elledge, and Graham C. Walker. Isolation      and Characterization of Tn5 Insertion Mutations in the lexA Gene of          Escherichia coli, Journal of Bacteriology, 153. 1368-1378, 1983.

4. Miller, J.H, Experiments in molecular genetics, Cold Spring Harbor            Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y, 1972..

5. P. Quillardet, G. Frelat, V. D. Nguyen and M. Hofnung, Detaction of           ionizing radiations with the SOS Chromotest, a bacterial short-term test      for genotoxic agents, Mutation Research, 216, 251-257, 1989

Fig 1. Induction of ACV1003 at 30℃

Fig 2. Induction of ACV1003 at 37℃

Table 2. Responses ratios of Temperatures and Consentrations

Promoter	Temp(℃)	Conc. of inducer	Response ratio
recA	30℃	1□g./ml	7.484
		0.1□g./ml	3.213
		0,01□g./ml	2.274
	37℃	1□g./ml	6.394
		0.1□g./ml	4.529
		0.01□g./ml	1.714
dinD	30℃	1□g./ml	2.319
		0.1□g./ml	1.759
		0.01□g./ml	1.314
	37℃	1□g./ml	2.535
		0.1□g./m1	1.971
		0.01□g./ml	1.263