새로운 종속 영양 세균 Citrobacter sp. Y19을 이용한 일산화탄소로부터의 수소생산: 성장조건 및 환경요인이 수소생산에 미치는 영향

김중래*, 정현옥*, 박지영*, 정규열**, 박성훈*,**

부산대학교 화학공학과*, 부산대학교 환경기술·산업개발 연구센터**

Production of H2 from CO by a New Chemoheterotrophic Bacterium  Citrobacter sp. Y19: Effect of Growth and Environmental Conditions on Hydrogen Production Activity

Jung Rae Kim*, Hyun Ok Jung*, Ji Young Park*, Gyoo Yeol Jung**, Sunghoon Park*,**

Department of Chemical Engineering, Pusan National University*

Institute for Environmental Technology and Industry, Pusan National University**

서론

수소에너지는 효율이 높고 수송과 저장이 용이한 에너지원이다. 또한 최종  연소생성물이 물이므로 대기오염 물질을 방출시키지 않는 미래의 청정에너지로서 크게 각광받고 있다. 현재 수소생산을 위해 시도되고 있는 공정은 크게 화학적 공정과 생물학적 공정으로 나누어진다. 이중 전자는 화학 촉매를 사용하고 고온 고압하에서 여러단계의 반응을 거쳐야 하는 단점이 있다. 한편 생물학적 전환공정은 혐기성 미생물에 의한 환원당의 발효, 광합성 미생물을 사용한 물의 광분해, 그리고 일산화탄소를 물과 반응시켜 수소와 CO2를 얻는 microbial shift reaction이 많이 연구되어 왔다. 이중 microbial shift reaction은 제철소 폐가스의 대부분을 차지하는 유독한 일산화탄소로부터 수소를 생산함으로써 환경오염을 방지하는 동시에 대체에너지인 수소를 상온 상압에서 생산할수 있다는 장점 때문에 최근 많이 연구되고 있다. 그러나 현재 이 반응에 사용되는 미생물은 대부분 성장에 빛이 필요한 광합성 미생물이며 성장속도가 낮고 극미량의 산소에 대해서도 활성에 저해를 받는등 실제 산업현장에 적용하기에는 많은 어려움이 있다.(3, 5)

본 연구실에서는 최근 기존 일산화탄소 이용 미생물의 단점을 보완할수 있는 Citrobacter sp. Y19을 분리 동정하였으며 이의 기초적인 배양방법과 동력학적 특성 등을 연구한 바있다.(4) Citrobacter sp. Y19은 지금까지 최적의 균주로 알려진 Rhodospirillum rubrum보다 수소생산속도가 2-3배 높았고, 성장속도도 빨랐으며, 성장에 빛을 필요로 하지 않는 등의 많은 장점이 있다.(6, 7) 그러나 Y19은 유기 탄소원이 풍부한 성장배지에서 성장시킨 후 이를 결핍시킨 수소생산 배지로 세포를 옮겨야하는 것과 호기적으로 성장시킨 후 저농도의 일산화탄소에서 장시간 적응 기간을 거쳐야 하는등 연속공정의 반응기를 운전하는데 있어 운전상의 문제점을 지니고 있다.

본 연구에서는 이러한 문제점을 해결하고자 회분식 조건에서 다양한 탄소원에 대한 실험으로 성장과 수소생산을 동시에 수행할 수 있는 배지를 개발하고,  성장에 필요한 적절한 일산화탄소의 농도를 결정하여 Citrobacter sp. Y19의 배양조건을  최적화하는 것을 목적으로 하였다.

실험

균주 및 배양조건

본 연구에 사용된 균주는 통성 혐기성 화학종속 영양 세균인 Citrobacter sp. Y19이며 미생물 성장에는 Bacto tryptone 10g/L, Yeast extract 5g/L가 첨가된 PFN(+) 배지를 사용하였다.(7) 모든 실험은 30℃, 250rpm rotary shaking incubator (KMC 8480 Vision Co. Korea)에서 실시하였다. 사용된 용기는 aluminum seal로 밀폐된 165mL serum bottle이고 working volume은 50mL이었다.

가스 및 균체 농도 측정

수소와 일산화탄소 분석을 위해서는 molecular sieve 5A column과 열전도도 검출기가 장착된 gas chromatography (DS6200 Donam Systems Inc.)에서 행하였다.균체농도는 spectrophotometer (Lamda 20, Perkin Elmer Co. USA)을 이용하여 Optical Density(OD600)값을 측정, 미리 구한 검량선으로부터 결정하였다.

수소생산활성 측정

균체내 효소 활성을 측정하기 위하여 배양한 균체를 10000rpm에서 3분 동안 원심분리하여 배양액을 제거한 후 pH 7.0 MOPS buffer로 1회 세척하였다. serum vial 내의 균체농도가 0.1-0.4mg dry wt/mL이 되도록 buffer로 희석하여 투입하였다. vial내에 Ar gas로 혐기상태를 조성한 후 기질로서 일산화탄소를 20% 투입하여 30℃ 진탕 항온조(KMC-1205 SWI, Vision Co. Korea)에서 분당 160회 왕복시켜 1시간동안 발생한 수소의 양을 gas chromatography로 분석, 활성을 측정하였다.

결과 및 토론

성장조건의 최적화

현재까지 알려진 다른 수소생성균들과는 달리 Citrobacter sp. Y19는  호기상태에서 유기 탄소원을 사용하여 성장하고 혐기상태에서 수소를 생산하는 특징을 가진다. 그러므로 Y19의 경우 성장조건과 수소생산조건을 분리하는 2단계 배양이 적절하다. 본 실험에서는 배지조성과 환경인자를 최적화하여 높은 미생물 농도와 수소생산활성을 가지는 성장조건을 확립하고자 하였다. Citrobacter sp. Y19의 성장과 수소생산활성에 영향을 미치는 주요인자는 탄소원과 성장기의 일산화탄소 농도등을 들수 있다. 기초적인 배양방법의 연구를 통해 Y19은 bacto tryptone을 탄소원으로 사용하여 호기적으로 성장했을 때 수소생산활성이 낮았다. 따라서 수소생산활성을 높일수 있는 다른 탄소원을 선정하기 위해 여러 종류의 탄소원에 대해 검토한 결과 sucrose와 citrate를 첨가한 배지에서는 높은 성장속도와 수소생산활성을 나타냈다.(Fig. 1) 또한 Sucrose의 이용성을 조사하기 위해  균체 수율을 측정한 결과 5g sucrose /L에서 0.326g cell/g sucrose로 가장 높은 수율을 나타내었으며 이때의 최대비성장속도와 미생물 농도는 각각 0.6h-1 과 2.0 g/L였다. (Fig. 2)

Fig 1. Effect of carbon source on	hydrogen production activity

위의 실험으로부터 수소생산활성과 이용성을 고려하여 sucrose와 citrate를 적절한 탄소원으로 선정하였으며 각각의 최적농도는 5g/L, 2.5g/L였다.  또한 Y19의 성장을 위해서는 pH 5∼8, 30∼40℃가 최적이었으며 상당히 넓은 범위에서 성장이 가능하였다. (data not shown)

Fig. 2 Cell growth of Y19 at various	sucrose concentrations.

symbols:-●-, 0g/L; -○-, 2g/L; -▼-, 5g/L;

-▽-, 8g/L; -■-, 10g/L.

Fig. 3 Effect of gaseous CO concentration         on hydrogen production activity

한편 기초적인 배양방법의 연구를 통해 Citrobacter sp. Y19은 일산화탄소를 기상에 투입하여 호기적으로 성장시킨경우는 그렇지않은 경우보다 혐기상태에서 수소생산활성의 회복이 빨랐다.(7) 그러나 일반적으로 일산화탄소는 미생물의 성장에 독성물질로 작용하므로 적절한 성장기의 일산화탄소 농도를 찾기위하여 기상의 일산화탄소의 농도를 0 ∼ 50% (v/v)로 조정하여 성장시킨후 수소생산활성을 측정하였다. 실험 결과 5%(v/v)의 일산화탄소 농도에서 가장 높은 수소생산활성의 증가를 나타냈으며 또한 성장을 저해하지도 않았다.

수소생산조건의 최적화

Citrobacter sp. Y19의 수소생산활성에 미치는 온도와 pH의 영향은 연속공정에서 운전 변수와 안정성을 결정하는데 중요한 영향을 미친다. Citrobacter sp. 의 수소생산활성에 대한 최적 조건을 확립하기 위해 여러 pH와 온도에서 수소생산활성을 비교하였다. 실험결과 pH 5.5∼7.5에서 수소생산활성이 최대값을 나타냈으며 이는 최적 성장조건과 대략 일치하였다.(Fig. 4) 또한 온도의 경우 50℃에서 가장 높은 수소생산활성을 나타냈으나 고온에서 활성의 급격한 감소를 보였으므로 효소활성의 안정성 측면을 고려할 때 30∼40 ℃가 최적 생산조건임을 알 수 있었다. (Fig. 5) 위의 조건에서 Y19의 최대수소생산속도는 33mmol/hr·g cell이었으며 생성물인 수소에 대한 저해효과는 없는 것으로 나타났다. (4,7)

실험결과 Citrobacter sp. Y19은 상당히 넓은 온도와 pH에서 높은 수소생산활성과 안정성을 가지므로 연속 수소생산공정에 적용할때 유연한 운전이 가능한 장점을 가지고 있다.

감사의 글

본 연구는 산업자원부 연구비지원에 의해 수행되었으며 이에 감사드립니다.

(a)	(b)

(a)	(b)

Fig 3. Effect of pH on hydrogen production  activity (a)  and  stability (b).

symbols: -●-, pH 4.0; -○-, pH 5.0; -▼-, pH 6.0; -▽-, pH 6.5; -■-, pH 7.0; -□-, pH 7.5;

-◆-, pH 8.0; and -◇-, pH 9.5.

Fig 4. Effect of temperature on hydrogen production  activity (a) and stability (b).

symbols: -●-, 25℃; -○-, 30℃; -▼-, 35℃; -▽-, 40℃; -■-, 45℃; -□-, 50℃;

and, -◆-, 60℃.

참고 문헌

1. Elena N. K. and Ivan. N. G.: Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 28,                  139(1983).

2. Michael W. A.: Biochim. et Biophysic. Act, 1020, 115(1990).

3. John. B.: Nature Biotechnol. 14, 1101(1996).

4. Kim J. R., Jung H. O., Jung G. Y. and Park S. H.: Proceedings of KIChE Fall     Meeting(1998).

5. Nandi R. and Sengupta S.:  Critic. Rev. Microbiol. 24(1), 61(1998).

6. Jung G. Y., Jung H. O., Kim J. R., Ahn Y. H. and Park S. H.:  Biotech. Lett.      21, 525(1999).

7. Jung G. Y., Kim J. R. Jung H. O., Park J. Y., and Park S. H.: Biotech. Lett.        Accepted(1999).