녹차로부터 카테킨 화합물의 추출 및 정제

(Ⅳ) 충진물질 크기의 영향

강 지 훈·홍 승 범·정 성 택·노 경 호

인하대학교, 화학공학과

Extraction and Purification of Catechin Compounds from Green Tea

(Ⅳ) Packing Size Effect

Ji Hoon Kang·Seung Bum Hong·Sung Taik Chung·Kyung Ho Row

Dept. of Chem. Eng., Inha University, Inchon 402-751, Korea

서론

녹차의 생리 활성 물질인 카테킨 화합물은 추출 및 정제과정이 복잡하고 수율이 낮고 가격이 비싸다는 단점뿐만 아니라 이 성분과 생체내에서의 작용에 관련된 연구는 많지 않다. 그러나, 1980년대 이후 녹차에 함유된 카테킨 화합물에 항산화 효과가 있다는 연구 결과가 보고되고 최근에는 특히 십이지장암, 결장암, 피부암, 위암, 폐암 및 유방암, 간암, 대장암, 식도암, 췌장암 등을 억제하고 방광암, 전립선암, 자궁경부암의 예방에 효과가 있다고 알려졌다[1,2]. 이러한 항암작용 뿐만 아니라 치매예방, 에이즈 바이러스 억제 및 전자파 방어효과, 환경호르몬(내분비계 교란화학물질)인 다이옥신이 소화관에서 흡수되는 것을 억제하고 변중의 배설량을 늘리며 간장에 분포되는 양을 줄이는 등의 다양한 효능이 보고되고 있다. 녹차의 카테킨 화합물 중 가장 관심을 모으는 물질은 EGCG(Epigallo-

catechin Gallate)로서, 가장 강력한 효능을 지닌 것으로 평가되고 있다. EGCG의 화학적 구조식은 C22H18O11이고 [2R,3R]-2-[3,4,5-Trihydroxyphenyl]-3,4-

dihydro-1[2H]-benzopyran-3,5,7-triol 3-[3,4,5-trihydroxybenzoate]로서 지칭되고 있다. EGCG는 정상세포에 영향을 끼치지 않고, 여러 암세포를 죽이는 무독성 항암제로 인식되면서 더 많은 관심의 대상이 되고 있으며[3], 최근에 미국 퍼듀대학 도로시 모어라이와 제임스 모어라이 부부교수팀은 녹차의 EGCG라는 화합물이 암세포 성장에 필요한 효소의 분비를 억제해 암세포를 죽인다는 사실을 입증하여 녹차의 항암 메커니즘을 처음으로 밝혀냈다. 따라서 EGCG와 다른 카테킨 화합물 및 녹차의 효능에 대한 연구개발이 더욱 활발히 진행되고 있다.

Bronner 등은 C18 column에 acetonitrile-acetate, acetonitrile-ascorbate, methanol-acetate의 이동상으로 녹차, 자스민차, 홍차에 함유되어 있는 카테킨 화합물을 분리하고 정량하였고[4], 국내에서는 50℃의 물로 녹차를 추출하여 클로로포름과 에틸아세테이트로 분배한 후 □-Bondapak column을 사용하여 0.1% acetic acid in water/acetonitrile=87/13 (vol.%)의 이동상과 1□/min, UV 280nm에서 RP-HPLC로 카테킨 화합물을 분리하였다[5]. 이와 같이, 카테킨 화합물의 추출, 분배, HPLC 분리와 효능에 관한 연구가 국외 및 국내에서 많이 진행되고 있다.

본 연구의 목적은 녹차에 많이 함유되어 있는 카테킨 화합물중 순수한 EGCG를 추출하여 분리하기 위하여 packing size의 영향을 실험적으로 확인하여 제조용 크로마토그래피 분리에 대한 기초적인 data를 제시하는 것이다.

실험

1. 실험재료 및 기기

본 실험에 사용된 녹차는 전라남도 보성에서 1999년 6월에 재배된 차를 구입하여 사용하였으며, 표준시료 물질인 (±)-Catechin, (-)-Epicatechin(EC), (-)-Epigallocatechin Gallate(EGCG), (-)-Epigallocatechin, (-)-Epicatechin Gallate는 Janssen Chimica와 SIGMA에서 구입하였으며, Methanol, Acetonitrile은 ACS Grade를 국내에서 구입하였고, Water는 2차 증류한 증류수를 사용하였다.

추출한 시료를 농축하기 위해 회전식 증발기(LABO-THERM SW 200, Resona Technics Co.)를 사용하였으며, HPLC는 Waters사의 600E, 616 펌프(multisolvent delivery system), 486 UV-visible tunable wavelength absorbance, 2486 Dual □ absorbance detecter, U6K 주입기(2□ sample loop), Rheodyne 주입기(2□ sample loop)를 사용하였고, 데이터 저장 시스템(data acquisition system)은 Chromate(ver. 3.0, Interface Eng.)와 Millennium32(Waters)를 사용하였다.

2. 추출, 정제 및 분석

국내에서 재배된 녹차 5g에 순수한 물 150□를 넣고 50℃, 300rpm, 4시간동안  교반기에서 교반하여 추출을 하였다. 추출이 끝난 추출액은 10분동안 원심분리(4000rpm)한 후, 여과하여 rotary evaporator를 사용하여 60℃이하에서 농축하였다. 농축액에서 불순물을 제거하기 위해 chloroform을 이용하여 1:1(vol. %)로 분배한 후, 물층을 다시 ethyl acetate를 이용하여 1:1(vol. %)로 분배하였다.

정제는 semi-preparative HPLC를 이용하였고, 15□와 40-63□의 제조용 충전물이 채워진 chromatographic column(250×4.60□)을 사용하였다. Mobile phase는 0.1% acetic acid in water/acetonitrile=87/13(vol.%), flow rate 1.0□/min, detecter UV 280nm로 추출액중에서 EGCG를 정제하여 농축하였다.

분석은 RP-HPLC를 이용하였고, column은 분석용 □-Bondapak(3.9×300mm, 10□) column을 사용하였다. □-Bondapak column은 mobile phase로 0.1% acetic acid in water/acetonitrile=87/13(vol.%), flow rate 1.0□/min, detecter UV 280nm, injection volume 20□로 농축액을 분석하였다.

결과 및 고찰

녹차에 함유되어 있는 카테킨 화합물을 추출하기 위하여 순수한 물 50℃에서 300rpm으로 4시간동안 추출을 하고, 불순물을 제거하기 위해 chloroform과 ethyl acetate로 분배하였다.

Ethyl acetate층에 있는 EGCG를 분리하기 위해 40-63□ packing이 채워진 chromatographic column을 사용하여 분석한 결과가 Figs. 1과 2에 나타나있다. Fig. 1의 이동상의 조성은 0.1% acetic acid in water/acetonitrile=87/13(vol.%)이었다. Fig. 2는 선형함수형 구배용매 조성법으로 초기 이동상의 조성은 0.1% acetic acid in water/acetonitrile=95/5(vol.%), 10분까지 90/10, 20분까지 80/20, 130분까지 75/25이었다.

Fig. 1에서는 Chung 등[5]의 15□ packing과 비교했을 때, packing size가 크기 때문에 분리도와 분리시간이 크게 떨어지는 것을 알 수 있었고, EGCG가 너무 넓게 분포되기 때문에 포집을 하기에도 어려움이 있었다. Fig. 2에서는 (+)C, EC, EGCG가 잘 분리되지는 않지만, 3개의 카테킨 화합물외에 불순물을 제거할 수 있었기 때문에 순도와 yield를 높이기 위한 정제공정의 첫 번째 단계로 사용할 수 있음을 확인하였다.

Fig. 3은 15□ packing으로 정제과정을 거쳐 농축시킨 후 RP-HPLC로 분석한 결과이다. 이동상의 조성은 0.1% acetic acid in water/acetonitrile=87/13(vol.%)이고 유량은 1.0□/min이었다.

알림

본 연구는 과학재단 핵심전문연구(과제번호 : 981-1102-006-2)의 지원에 의하여 고순도 분리 연구실에서 수행되었으며, 이에 감사드립니다.

참고문헌

1. Choi, S. H., Kim, S. H. and Lee, B. H. : J. Korean Soc. Food Nutr., 22(4),     374(1993).

2. Santosh, K., Rajesh, A., Susan, E., Gary, S. W. and Hasan, M. :              Carcinogenesis, 14, 361(1993).

3. Ahmad, N., Feyes, DK., Nieminen, AL., Agarwal, R. and Mukhtar, H. : J.      Natl. Cancer Inst., 89(24), 1881(1997).

4. Bronner, W. E. and Beecher, G. R. : Journal of Chromatography A, 805,       137(1998)

5. Chung, S. T., Row, K. H., Kang, J. H. and Park, Y. K. : pending to           Korean Patent, No. 42877, (1998).

Fig. 1. Preparative separation of Catechin compounds from Green Tea

(40-63□ column, 0.1% acetic acid in water/ACN=87/13 vol.%,

1.0□/min, 10□ injection volume)

Fig. 2. Preparative linear-gradient separation of Catechin compounds from             Green Tea

(40-63□ column, 0.1% acetic acid in water/ACN=95/5 vol.%,

after 10min : 90/10, after 20min : 80/20, after 130min : 75/25,

1.0□/min, 10□ injection volume)

Fig. 3. Analysis of EGCG from Green Tea by □-Bondapak column

(0.1% acetic acid in water/ACN=87/13 vol.%,  1.0□/min,

20□ injection volume)