크로마토그래피를 이용한 키랄 의약품 분리

송태호, 서성섭, 최민호, 박달근*, 이중기*

한국과학기술연구원 청정기술 센터*, 홍익대학교 화학공학과

Separation of Chiral drugs by using a chromatography

Tae Ho Song, Sung-Sup Suh ,Min-Ho Choi, DalKeun Park*, Joong Kee Lee*

Clean Technology Reserch Center,  KIST*, Dept. of Chem. Eng. Hongik Univ.

서론

현재 전 세계적인 의약품 산업 경향 중의 하나는 원하는 의약효과만을 나타내는 단일 enantiomer의 키랄 약품을 생산하는 것이며 이에 관한 많은 연구 개발이 선진국에서 진행 중에 있다. 그 이유로서 일반적으로 생산되는 합성의약품에서 거울상 이성질체 중 어느 한쪽만이 의약적 효능이 있을 뿐 나머지 다른 형태의 거울상 이성질체는 각종 부작용의 원인으로 보고되었기 때문이다[1]. 따라서 의약품 생산에 있어서는 원하는 순수한 성질의 물질만을 얻는 것이 대단히 중요하기 때문에 키랄 의약품을 고순도로 분리 및 정제하는 것이 더욱 필요해지고 있다.

단일 enantiomer의 키랄 약품개발 방향은 새로운 합성방법 개발과 기존 라세미 혼합물을 분리하는 방법이 있으나, 크로마토그래피 기술에 의한 단일 enantiomer 분리기술은 asymmetric 합성방법과 같은 새로운 합성방법에 비해 시간과 개발비를 크게 줄일 수 있는 장점이 있다.

본 연구의 실험대상인 (R,S)-Ibuprofen[(□)-(R,S)-2-(4-isobutylpheyl)propionic aci  d]는 전형적인 비스테로이드성 소염진통제(NSAID)로서 류마티즘, 암, 등의 진통제 외에 여러 가지 용도로 널리 사용되는 치료약이다. 그러나 Ibuprofen이 치료약으로 사용될 때에  라세미혼합물 상태로 사용되고 있는데[2,3] S-(+)-Ibuprofen만이 약물학적 효과를 나타내고 R-(+)-Ibuprofen은 여러 가지 좋지 못한 부 효과를 나타내는 문제점이 있다[4].

본 연구에서 수행한 실험에서는 라세미혼합물 상태인 Ibuprofen을 분리하기 위하여 분리를 가능하게 할 것으로 예측되는 서로 다른 고정상들을 사용하였으며,  분리하고자 하는 Ibuprofen의 분자식에 근거하여 선택된 키랄 분리용 고정상 물질을 사용한 칼럼을 가지고 실험을 하였다. 또한 여러가지 종류의 고정상에 대하여 실험조건의 변화에 따른 분리도의 변화를 관찰하여 실험조건의 변화가 분리도에 미치는 인자를 조절하면서 라세미 Ibuprofen의 분리도를 높일 수 있는 실험조건을 조사하였다.

실험

본 실험에 사용된 HPLC의 칼럼은 4종류로서 YMC사(Japan)의 □-CD BR□[□-cyclodextrin based colum]과 ODS-H80□[실리카젤에 C18을 결합시킨 칼럼]을 구입하여 사용하였고, 충진제로 개발중인 □-CD[실리카젤과 □-cyclodextrin이 amine functional group으로 연결된 고정상물질]와 Kromasil□충진제(Eka chem . ,Sweden)를  내경이 4.6mm, 길이가 250mm인 stainless-steel 칼럼(Alltech)에 슬러리 팩킹하여 사용하였다.  □-CD를 슬러리 상태로 만들어 주기 위한 용매는 ethanol[HPLC grade]을 사용하였으며 슬러리로 분산하기 위해서는 sonicater를 사용하였다. 이때 충진 칼럼에 압력을 가하기 위한 용매도 슬러리 용매와 같은 ethanol을 사용하였다.  Kromasil□에 사용된 슬러리 용매는 methanol/acetone [50/50,v/v%]혼합물 이었고 가압 용매로는 methanol을 사용하였다.

실험에 사용한 이동상 용매는 [0.1M]ammonium acetate[ammonium acetate, 99.99% + HPLC water], aceonitril[Baker Analyzed□ HPLC Solvent], hexanes(95% n-hexane), tert-butyl methyl ether[99.8%,HPLC grade,Aldrich Chmical Co.], acetic acid, Glaial[Baker Analyzed'□ HPLC Reagent], methanol[ChromAR□HPLC], water[Baker Analyzed'□ HPLC Reagent]를 사용하였다. 실험에 사용된 Ibuprofen의 라세미혼합물 상태는 삼일제약에서 제공받은 것과 USP reference standard[U.S.P.C.,INC]를 사용하였다.

실험장치로서 팩킹 물질을 충진하기위해 슬러리 팩커[Altech model 1666]를 사용하였고 HPLC를 주요 부분별로 나누면 고압펌프[Waters 510], Injector, 칼럼, UV spectrometer[waters, Lambada-Max model 481] 및 data acquisition [Young-Lin, Autochro win]으로 나눌 수 있다.  UV detector는 데이터 모듈에 연결되어 모듈에서 PC로 데이터를 전달해 peak의 면적과 높이, retention time등을 얻을 수 있다.

분리도는 다음과 같은 식에 의해서 측정하였다.

[eqn: R~=~{t sub{2}~-~t sub{1}} over {{(w sub{2}~+~w sub{1})}/2}~=~{2△t} over {w sub{2}~+~w sub{1}}].......................................( 1 )

t1, t2는 시료 1, 2의 체류시간이며, w1, w2은 시간단위로서 peak 1, 2의 기준선에서의 폭이다. 칼럼의 효율은 baseline에서 측정한 peak의 폭(w)을 이용한 다음 식에 의해서 측정하였다.  [eqn: N = 16 LEFT ( { { t_R} over {w } }RIGHT ) ^{2 }].........................................( 2 )

결과 및 고찰

라세미 Ibuprofen의 분리를 위해 사용된 4가지의 칼럼 중에서 충분한 분리를 달성 할 수 있는 조건을 얻기 위한 고정상으로서 충진제의 종류, 이동상으로서 용매의 종류를 선정하였다. 실험에 사용된 칼럼인 □-CD BR□, ODS-H80□, □-CD, Kromasil□ 각각의 칼럼에서 이동상 유속을 1ml/min로 고정시킨 채로 시간의 함수로서 크로마토그램을 Fig. 1에나타내었다. Fig. 1을 보면 ODS-H80□칼럼은 분석시료가 칼럼내의 체류시간이 20분 정도를 나타내면서도 peak의 전면과 후면에서 퍼짐이 없이 날카로운 형태를 갖음으로서 단일 peak의 이론단수가 매우 높음을 알 수 있고 칼럼효율도 좋을 것으로 예측된다.  그러나 Ibuprofen 분리목적에 맞는 두 개의 peak가 나타나지 못하였고 단일 peak만이 나타남으로서 Ibuprofen의 분리에 적합하지 못하다는 것을 알 수 있다.  □-CD칼럼에서는 분석시료의 체류시간이 4분 이내로서 단일 peak를 나타내었고 peak후면의 퍼짐 현상[tailing]의 모양을 나타내었다. Ibuprofen이 ODS-H80칼럼보다는 빠른 속도로 칼럼을 통과하지만 그에 비하여 물질전달의 영향은 더 커지고 칼럼의 효율도 좋지 못 할 뿐만 아니라 분리도 되지 못하는 것을 알 수 있다. 이런 결과로서 실리카젤과 □-cyclodextrin이 amine functional group으로 연결된 고정상 물질[□-CD]은 키랄 특성을 가지는 라세미 Ibuprofen의 광학적 분리를 하지 못한다고 사료된다. 그러나 크로마토그램 결과 Fig. 1의 [a]와[d]에 보여지는 것처럼  □-CD BR□ 과 Kromasil□ 칼럼은 라세미 Ibuprofen을 분리하여 주는 것으로 나타나서 이런 약품의 광학적 분리를 가능하게 해줌을 알 수 있었다.  따라서 라세미 Ibuprofen의 분리가 가능한 □-CD BR□ 과 Kromasil□ 두 개의 칼럼에 대해서 실험조건의 변화에 따른 분리도의 변화를 수행하였다.

Fig.1.   Elution pofiles of racemic ibupofen for various species of chiral column.

[a] □-CD BR□ column [b]ODS-H80□column [c]□-CD□column [d] Kromasil□column

□-CD BR□칼럼을 사용하는데 선택된 이동상이 Ibuprofen의 분리에 미치는 영향을 살펴보기 위하여 이동상의 조성비를 변화시켜 실험을 하였다. 실험결과 이동상 조성비의 변화가 분리도와 선택도에 영향을 주는 것을  알 수 있었는데  [0.1M]ammonium acetate가 증가할수록 선택도는 증가하였지만 선택도의 증가가 분리도를 반드시 증가시키는 것으로 나타나지는 않았다. □-CD BR□칼럼에서는 분리도를 가장 크게 높일 수 있는 분리조건이 [0.1M]ammonium acetate가 30%인 경우임을 알 수 있었다.

Kromasil□칼럼에서 시료의 주입농도는 100ppm으로 하고 주입부피는 20□로 고정하여 유속을 1.0∼2.0ml/min로 증가시키면서 이동상내에 hexane과 tert-butyl methyl ether의 부피비를 변화시키면서 실험한 결과 hexane의 조성비가 85%와 75%에서는 거의 비슷한 분리도를 나타내었다. 여기서  hexane이 75%에서 약간 좋은 분리도를 보여주었으며 hexane의 조성비가 60%로 줄어들게 되면 분리도가 감소하였다. 이런 실험결과로부터 Kromasil□칼럼에서 분리도를 최대로 해줄 수 있는 최적의 이동상 조성비는 hexne/tert-butyl methyl ether/acetic acid [75/25/ 0.1,v/v%]임을 알 수 있었다.

라세미 Ibuprofen의 분리를 가능하게 해주는 두 개의 칼럼을 비교하기 위하여 최적의 이동상 조성비에서 Kromasil□칼럼과 □-CD BR□칼럼을 비교하여 보았다. 시료농도는 1000ppm으로 주입하고 주입 부피는 5□로 고정시킨 상태에서 이동상 유속을 증가시키면서 실험한 결과 동일한 실험 조건에서 Kromasil□칼럼의 분리도가 더 좋은 것을 Fig.2로부터 알 수 있다.  일반적으로 분리도가 1.5이상이 될 때 두 개의 peak가 중첩되지 않는 분리가 이루어진다는 것을 고려하면 두 개의 칼럼에서 모두 두 개의 peak가 확실히 분리가 되었으나 Kromasil□ 칼럼의 경우 band broadening도 작았고 분리도는 2.0이상이 되는 좋은 결과를 나타내었다.

Kromasil□칼럼을 사용하여 시료의 주입농도는 hexane내에 100ppm으로 고정시키고 서로 다른 주입부피에서 이동상 유속의 증가에 따른 분리도의 변화와 서로다른 이동상 유속에서 주입부피의 증가에 따른 분리도의 변화를 Fig.3에 나타내었다. Fig.3[a]를 보면 서로 다른 주입부피에서  이동상 유속이 증가하면 분리도는 감소하는 경향을 보이며 유속이 느린 경우에는 주입부피가 분리도에 영향을 주는 것을 알 수 있다. 그러나 유속이 3ml/min에서는 주입부피의 변화가 분리도에 미치는 영향이 미소함을 알 수 있다. Fig.3[b]에서는 각각의 이동상 유속에서 주입부피의 증가가 분리도에 미치는 영향을 알 수 있다.  유속이 1.0ml/min로부터 3.0ml/min 까지 각각의 유속에서 살펴보면 1.0ml/min에서 주입부피의 증가에 따라서 분리도는 감소하는 형태를 갖는 것을 쉽게 알 수 있으나 유속이 증가함에 따라 주입부피의 증가가 분리도에 미치는 영향이 거의 사라짐을 알 수 있다.

Kromasil□칼럼을 사용하여 라세미 Ibuprofen을 분리하는 공정에 있어서 주입부피의 영향이 이동상 유량의 영향에 비하여 칼럼 효율에 상대적으로 작은 영향을 준다는 것을 알 수 있었다. 한편 이동상 유량이 일정한 값 이상으로 증가하게 되면 주입부피의 증가가 분리공정의 분리도를 감소시키지 않음으로서 공정의 생산성을 확보하는데 유리 할 수 있을 것으로 예측 할 수 있었다.

Fig.3. (a) Change of resolution with eluent flow rate.                                  (b) Change of resolution with the amount of injection volume.                      [Kromasil□column, Injection concentration; 100ppm]

Fig.2.  Comparison of resolution with          eluent flow rate between□-CD         BR□ and Kromasil□ column.            [Injection concentration;1000ppm,

Injecion volume ;5□]

참고문헌

1.  Ravi, B. and J□rgen, M. : Biomedical chromatogrphy, 309, 12, (1998)

2. Yoshio, O., Ryo, A., Kazuhiro, H. and Koichi, H.: J. of Liquid                  chromatography, 2147, 11(9&10), (1988)

3. S, C, Tan., S, H, D,Jackson., C, G, Swift., J. of ChromatographyB.:              53, 701, (1997)

4.  Wright, M, R., Sattari, S., Brocks, D. R. ; J. of chromatogr. Bimed. Appl.:       259, 121, (1992)