키토산 유도체 고분자 매트릭스로부터 약물 방출 조절(Ⅱ)

나재운, 장미경*, 이동병**, 전현정

순천대학교 공과대학 고분자공학과, *경상대학교 자연과학대학 화학과

Control of Drug Release from Polymeric Matrices of

Chitosan Derivatives(Ⅱ)

Jae-Woon Nah, Mi-Kyeong Jang*, Dong-Byung Lee**, Hyun-Jeong Jeon

Dept. of Polym. Sci. & Eng., Sunchon Nat'l Univ., Chonnam 540-742, Korea

*Dept. of Chem., Gyeongsang Nat'l Univ., Gyeongnam 660-701, Korea

**Dept. of Chemical Engineering, Chosun Univ., Kwangju 501-759, Korea

서   론

약물 전달 시스템(drug delivery system, DDS)에서 방출속도 제어불능의 경구투여 약물은 부작용 및 독성을 일으켜 치료 유효 혈중 농도(therapeutic plasma level)를 능가하며 급격한 약효의 하락은 치료를 더욱 어렵게 한다. 이러한 문제들을 해결하는데 방출 조절형 의약이 필요하게 되었고 키토산은 생체적합성, 생분해성, 무해성 등의 특성을 지니고 있다.

본 연구에서는 생체분해성 고분자로서 가장 많이 사용되고 있는 poly(DL-lactide)(DL-PLA)로 고분자 매트릭스에 피막을 형성하게 하는 새로운 약물 전달 시스템을 제시하였다. 이 제형의 목적은 높은 약물 방출속도를 유지하면서 급속한 약물의 방출속도 변화를 나타내는 문제점을 제거하기 위하여 고분자 피막을 입힌 키토산, 키토산 염산염 및 술폰화 키토산을 매트릭스로 이용하였으며, 모델 약물로는 항 류마티스 치료제인 prednisolone을 사용하였다. 따라서 고분자 매트릭스의 약물 방출 특성을 살펴보기 위하여 pH 7.4 인산염 완충용액에서 생체분해성 고분자 피막이 약물의 방출거동에 미치는 영향을 비교 검토함으로써 지속적이고 조절된 제형으로서의 사용 가능성을 고찰하였다.

실  험

1. 시약 및 기기

Prednisolone, DL-lactic acid, chlorosulfonic acid, antimony(Ⅲ) oxide 등은 Aldrich Chemical Co.의 제품을, dimethyl sulfoxide는 Yakuri Pure Chemical  Co.의 제품을 정제없이 그대로 사용하였다. Stannous octoate, tetrahydrofuran, dimethylformamide는 Sigma Chemical Co.의 특급 시약을 사용하였다. 기기로는 FT-NMR spectrophotometer(Bruker AC-300F, 300MHz), differential scanning calorimeter(DSC)(Mettler Co. DSC 30), FT-IR spectrophotometer(Bruker IFS66), GPC column(Shimazu GPC-800series), UV-VIS spectrophotometer(Shimazu 2101 PC)등을 사용하였다.

2. DL-PLA의 합성

DL-lactic acid 100 g과 antimony(Ⅲ) oxide 1.1 g을 질소기류 하에서 120℃로 2시간 동안 탈수반응시킨 후 온도를 180℃까지 높이고 5 mmHg에서 6시간 반응시켰다. 그 다음 반응기 내의 온도를 250∼260℃로 상승시켜 1시간 동안 반응시킨 후 연한 노란색의 부산물을 포함하고 있는 DL-lactide를 얻었다. 생성물을 클로로름과 아세트산 에틸로 재결정한 다음 동결건조하여 순수한 백색의 DL-lactide를 얻었다(1). DL-lactide 1.0 g, lauryl alcohol 0.1 g 및 stannous octoate 0.3 g을 질소기류 하에서 220℃로 4시간 동안 반응시켰다. 얻어진 생성물을 ethyl acetate/petroleum ether 혼합용매로 추출한 후 동결건조하여 백색의 DL-PLA를 얻었다.

3. 키토산 유도체 합성

(1) 키토산 합성

키틴 분말시료 40 g을 47）-수산화나트륨 400 mL 수용액으로 110℃에서 1시간 동안 탈아세틸화 반응을 한 후 증류수로 세척하였다. 이와 같은 과정을 3회 반복하여 탈아세틸화도를 높였다. 반응 종료 후 증류수로 충분히 씻어 알카리를 제거하고 무수 에탄올, 무수 에테르 등의 순서로 처리하여 80℃에서 진공건조하였다.

(2) 키토산 염산염 합성

키토산 6.0 g을 2）-초산 320 mL에 용해시킨 후에 과량의 35）-염산 수용액을 가하여 키토산의 염산염을 석출시켜 여과한 후 여액중에 Cl- 이온이 검출되지 않을 때까지 무수메탄올로 처리한 다음 진공건조하였다.

(3) 술폰화 키토산 합성

피리딘 100 mL와 클로로술폰산 16.8 mL을 약 5℃에서 혼합시킨 용액에 피리딘 60 mL에 키토산 10 g을 분산시킨 고분자용액을 서서히 dropping funnel을 이용하여 적가한 후 95℃에서 90분 동안 환류 반응시켰다. 이 반응물을 증류수 400 mL에 주가하여 얻은 생성물을 2.5 N-수산화나트륨 수용액과 에탄올로 처리하였으며 셀룰로오스 튜브에서 3일 동안 투석한 후에 무수에탄올 240 mL로 처리하여 70℃에서 진공건조하였다.

(4) 약물전달체 제조

키토산, 키토산 염산염 및 술폰화 키토산을 각각 10%-초산용액에 12시간동안 팽윤시켜 약물인 prednisolone을 가하여 교반한 다음 이 고분자 용액을 캐스팅하여 60℃에서 24시간동안 건조하였다. 건조된 고분자 매트릭스의 반지름은 6.30±0.01 mm, 두께는 각각 2.08, 2.09, 2.10±0.01 mm였다. 고분자 매트릭스의 피막 재질로는 DL-PLA를 사용하였다. DL-PLA를 약물이 분산된 고분자 매트릭스에 피막하기 위해서 dip coating 방법을 사용하였다. DL-PLA를 클로로포름에 녹인 후 이 고분자 용액에 고분자 매트릭스를 매달아 클로로포름의 액면이 낮아짐에 따라 피막이 형성 되도록 하였다. 피막용 고분자 용액은 클로로포름 10 mL에 DL-PLA 1.0 g을 녹여 만들었으며 피막은 1분간에 3회 처리하였다. 이때 피막의 두께는 0.07±0.01 mm 였다.

(5) 약물 방출 실험

약물 방출 실험장치는 in vitro에서 37.0±0.5℃의 pH 7.4 PBS 1000 mL에 대한 약물의 방출속도를 측정하였으며 교반속도는 100 rpm을 유지하였다. Sample 용액은 1회에 5 mL씩 처음 1시간 동안은 10분마다, 그 이후에는 1시간 간격으로 채취하여 약물의 농도를 측정하였으며 sample 용액을 꺼낸 직후에 동량의 PBS을 보충하였다. 방출된 약물의 농도는 UV-VIS spectrophotometer로 채취된 시료를 millipore filter(pore size 0.2□)를 통과시킨 후 최대파장 242 nm에서 pH 7.4 PBS를 대조로하여 그 흡광도를 측정하여 산출하였다.

(6) 키토산의 탈아세틸화도 측정

키토산 1.0 g을 증류수 100 mL와 0.4 M acetate buffer(pH 4.0) 100 mL의 혼합 용액에 용해시켰다. 용해된 키토산 콜로이드 용액 1.0 g을 채취하여 증류수 30 mL와 혼합하고 toluidine blue 지시약 2방울을 떨어뜨려 2.5 mN-potassium polyvinylsulfate 용액으로 적정하였다. 이때 용액의 색깔이 푸른색에서 보라색으로 변하는 점을 종말점으로 하여 탈아세틸화도(degree of deacetylation, DAC)를 계산하였다(2).

(7) 키토산의 점도 평균 분자량 측정

4 M urea-0.2 M CH3COOH-0.1 M NaCl(1:1:1, v/v) 혼합용액에 건조된 키토산 분말을 각각 0.05, 0.1, 0.15 및 0.2%가 되도록 용해하고 냉암소에 24시간 동안 방치하였다. 25.0±0.05℃ 항온조에서 각각 Cannon-Fenske형 모세관 점도계(Kimax No. 100)를 사용하여 모세관을 통과한 시간을 측정, 고유점도[□]를 계산하고 다음식으로부터 분자량을 계산하였다(3).

[□]=8.93×10-4Mw0.71 (□/g)

결과 및 고찰

1. DL-PLA의 구조 확인

DL-lactide는 1H-NMR에서 methyl group(-CH3)내의 3개의 수소가 1.66∼1.69 ppm 부근에서, methenyl group(≡CH)내의 1개 수소가 5.03∼5.10 ppm 부근에서 흡수피크를 보였으며, 13C-NMR에서 methyl group(-CH3)내의 탄소가 15.80 ppm에서, methine group(≡CH)내의 탄소가 72.25 ppm에서, ester group(-(C=O)O-)내의 탄소가 167.75 ppm에서 흡수피크를 보여 DL-lactide의 합성을 확인할 수 있었다. DL-lactide로부터 합성된 DL-PLA는  1H-NMR에서 -CH3내의 3개의 수소가 1.55∼1.60 ppm 부근에서, ≡CH내의 1개 수소가 5.13∼5.26 ppm 부근에서 흡수피크를 보였으며, 13C-NMR에서 -CH3내의 탄소가 16.62 ppm에서, ≡CH내의 탄소가 68.92 ppm에서, -(C=O)O-내의  탄소가 169.34∼169.59 ppm에서 흡수피크를 보여 DL-lactide의 합성을 확인할 수 있었다. DL-PLA의 고유점도[□]는 클로로포름에 녹여 Ubbelohde 점도계로 25℃에서 측정한 결과 고유점도는 0.917 dL/g이었으며, THF 용매에 녹여 GPC column을 사용하여 측정한 평균분자량(Mw)는 120000 이었다.

2. 키토산 유도체들의 구조 확인

키틴의 특성피크인 CH3 wagging 흡수가 952 cm-1에서, C=O결합 streching 흡수가 1655 cm-1에서 나타났으나 키토산에서는 매우 약하게 관측되었다. 키틴의 1550 cm-1의 NH bending 흡수피크만 키토산의 1552 cm-1에서 남아있어 키토산이 합성되었음을 확인할 수 있었다. 탈아세틸화에 따른 C=O와 NH결합 사이에 작용하는 수소결합력의 차이에 의해 키틴의 3250 cm-1와 3090 cm-1의 NH streching에 의한 흡수피크가 키토산의 경우에는 매우 약하게 나타났다. 키토산의 탈아세틸화도는 87%였으며, 점도 평균분자량은 4.0×104(고유점도[□] 1.653dL/g)이었다. 키토산으로부터 키토산 염산염을 합성한 FT-IR spectrum에서 특성피크인 NH3흡수가 1527 cm-1에서 streching, 2105 cm-1에서 broad하게 나타났다. 또한 술폰화 키토산의 특성피크인 S=O결합의 흡수가 1260 cm-1에서, N-S-O결합의 흡수가 706 cm-1에서 나타난 것으로 보아 술폰화 키토산이 합성되었음을 확인하였다.

3. 약물전달체가 약물 방출에 미치는 영향

약물로 사용된 prednisolone의 함유량을 0.2 g으로 동일하게 하고 약물전달체의 함유량을 각각 0.3, 0.6 및 1.0 g으로 변화시킨 후 시간에 대한 누적 약물방출량(%)과 시간의 제곱근(t1/2)에 대해 plot한 결과 t1/2에 대한 약물방출량의 증가가 직선적 관계를 나타내었다. 이는 고분자 매트릭스로부터 약물 방출이 조절된다는 것을 의미하며, 또한 방출 조절형에서 요구되는 지속성 방출 형태(sustained release pattern)를 보여주고 있다. 약물전달체의 함유량 증가에 따른 지속적인 약물 방출 시간은 키토산의 경우에 99, 105, 112시간이었고, 키토산 염산염의 경우는 69, 77, 82시간, 술폰화 키토산의 경우는 75, 81, 85시간으로 지연되었다. 또한 약물 방출속도는 키토산 염산염이 가장 높았고 그 다음이 술폰화 키토산, 키토산의 순서를 나타내었다.

4. 생체분해성 고분자 피막이 약물 방출에 미치는 영향

피막형 고분자 매트릭스는 초기 약물의 과량 방출량이 DL-PLA 피막에 의하여 현저히 줄어들었으며 피막되지 않은 경우보다 2배 정도의 방출시간이 지연되는 결과를 보였다. 즉 DL-PLA로 고분자 매트릭스에 피막을 함으로써 약물의 방출속도의 변화를 줄일 수 있었다. 결과적으로 이러한 생체분해성 고분자로 피막된 제제는 초기의 급격한 약물 방출속도의 변화를 줄이면서 지속성 약물 방출 형태를 나타내었다.

참 고 문 헌

1. Reed, A. M. : In Vivo and In Vitro Studies of Biodegradable Polymers for     Use in Medicine and Surgery, Ph. D. Thesis, University of Liverpool (1978).

2. Maeda, M., H. Murakami, H. Ohta, and M. Tajima : Stimulation of IgM       Production in Human-Human Hybridoma HB4C5 Cells by Chitosan,           Biosci. Biotech. Biochem., 56, 427-431 (1992).

3. Rutherford Ⅲ, F. A. and P. R. Austin : Chitin/Chitosan, Proc. 1st, Int'l        Conf., p.182, Held in Bostone (1978).