Rhodococcus rhodochrous IGTS8을 이용한 오일속의 다이벤조사이오펜 제거

김태준, 박홍우

한양대학교 화학공학과

Removal of dibenzothiophene in oil by Rhodococcus rhodochrous IGTS8                                                                                                                                                              Taejun Kim, Hongwoo Park

Department of Chemical Engineering, Hanyang University

서론                                                                         황은 석유에서 발견되는 탄소와 수소 다음으로 세 번째로 풍부한 원소로써 무 기 황과 유기 황 형태로 석유내에 존재한다.  석유의 황 함량은 산출지역에 따라 다르지만 0.04∼5wt% 범위로 존재한다1. 이러한 황을 함유하고 있는 석유를 연소 하면 이산화황이 생성되어 대기중으로 방출되므로 대기 환경에 많은 문제점을 야기한다. 가솔린이나 경유를 원료로 사용하는 자동차의 엔진 부식을 촉진시켜 수명 단축을 일으킬 수 있으며 산성비를 유발하여 금속을 부식시키거나 토양의 산성화를 촉진시켜 인간 생활에 직접적인 악영향을 끼친다. 그래서 이산화황 방 출을 억제하기 위한 노력으로 화학적 물리적 방법으로 석유에 함유되어 있는 황 을 제거하는 공정이 개발되었다.

지금까지 상용되고 있는 탈황방법은 원유를 수소 가스와 혼합시킨 후 고온, 고압 하에서 금속촉매와 반응시켜 H2S를 생성하는 황 제거 방법을 쓰고 있다. 그러나 유기유황은 높은 끓는점때문에 화학적 탈황 방법으로 황을 효율적으로 제거하기는 어렵다. 지금까지 밝혀진 유기유황은 약 200 여 종이나 되며 sulfide, thiol, thiophene 형태로 분류된다. 200℃이하의 끓는점을 갖고 있는 지방족 황화합물들은 간단한 화학적 방법으로 쉽게 탈황될 수 있으나 방향족 황화합물은 이러한 방법으로는 황 제거 효율이 떨어진다. 중유의 탈황은 특별한 촉매, 아주 높은 온도와 고압에서 제거가 될 수 있지만 결과적으로 비용이 높다는 점 때문에 널리 응용되지는 않았다. 또한 석유 내에 중금속의 농도가 높으면 중금속이 이 공정에서 사용되는 촉매를 중독시키기 때문에 탈황 공정 상용화에 제약이 따른다2.       생물학적인 탈황법은 상온, 상압하에서 반응이 가능하기 때문에 수소 탈황법보다는 경제적인 면에서 우수하다. 생물학적 탈황은 미생물이 성장하는데 황을 필요로 한다는 점에 착안하여 출발되었으며 지난 50년간 유기유황을 대사하는 미생물들이 분리되고 연구되어 왔다. 이것을 연구한 대부분의 과학자들은 황화합물로 dibenzothiophene을 모델화합물로 사용하였는데 그 이유는 dibenzothiophene 유도체들이 유기유황의 대부분을 차지하며 기존 수소 탈황법으로는 처리가 까다롭기 때문이다. 지금까지 분리된 미생물중 Rhodococcus rhodochrous IGTS8과 Rhodococcus erythropolis D-1은 다이벤조사이오펜을 탄소원이 아닌 황원으로 이용하여 탄소와 탄소 결합을 끊지 않고 탄소와 황 결합을 특이적으로 끊어버리는 특성을 보이며 최종생산물인 2-hydroxybiphenyl을 생성한다3,4.                                                                                                        본 연구에서는 다이벤조사이오펜을 분해하는 균주 Rhodococcus rhodochrous    IGTS8을 이용하여 기초적인 미생물 배양과 세포 성장 특성을 연구하고 oil내에 존재하는 DBT가 분해 혹은 제거되는 거동을 이해함으로써 효율적으로 DBT를 탈황시키거나 선택적으로 제거시키는 방법에 중점을 두었다.                                                                                               재료 및 실험 방법

본 연구에 사용된 세포는 NORTH DAKOTA 대학의 KEVIN YOUNG 박사님이 제공해 준 Rhodococcus sp. strain IGTS8(ATCC 53968)이다. 이 균주는 지름이 0.5□인 gram positive short rod 박테리아이며 nutrient agar상에서 자홍색의 colony를 형성하며 특이적으로 유기황의 C-S 결합을 끊는 특성을 가지고 있다3.             배양은 300ml 진탕플라스크에 nutrient broth 30ml를 넣어 shaking incubator(Vision Science 8480SR)에서 30℃, 200rpm으로 행하였으며 균주 저장은 2일 배양 후 원심분리시켜 세포를 농축시키고  0.1M phosphate buffer로 세포를 2번 씻어 낸 후 신선한 nutrient broth와 10% glycerol이 들어있는 용액에 현탁시킨 다음 2.0ml cryogenic vial(Corning, 25704-2)에 담아 -70℃에서 보관하였고 실험시 vial을 해동시켜 사용하였다. 실험에 사용된 sulfur-free basal salt defined medium(BSM) 조성은 2.44g/l KH2PO4, 5.57g/l Na2HPO4, 2.0g/l NH4Cl, 0.2g/l MgCl2.6H2O, 0.001g/l    CaCl2.2H2O, 0.001g/l FeCl3.6H2O, 0.004g/l MnCl2.4H2O, 8g/l glycerol, 5g/l glucose이었으며 증류수에 녹여 사용하였다5. 실험하기 전 해동된 세포를 nutrient broth에서 2일간 배양 후 원심분리하여 씻어준 후 BSM에 현탁시켜 A600에서 1로 맞춘 다음 사용하였다. 실험은 100ml 시험관(200×27mm)에서 행하였다. 그리고 배지 내에서 다이벤조사이오펜의 분산도를 높이기 위한 방법으로 dimethylformamide에 녹인 다이벤조사이오펜 용액(2%)을 만들어 0.5ml, 세포현탁액 1ml, BSM 9ml을 혼합하여 shaking incubator에서 30℃, 200rpm으로 배양하였다. 또한, 다양한 농도의 hexadecane을 넣고 배양하여 유화정도를 알아보았다.                                                                                                        분석방법                                                                     세포성장은 spectronic 20D(Miton Roy)를 사용하여 600nm에서 OD를 측정하였으나 분산된 dibenzothiophene이 OD측정에 간섭을 하기 때문에 200rpm, 5분동안 원심분리시켜 dibenzothiophene을 침전시킨 후 측정하였다. Dibenzothiophene과 2-hyd-roxybiphenyl은 □Bondapak C18 steel column(3.9mm×150mm, Waters), 254nm로 고정된 photodiode array detector (Waters 996), autosampler(Waters 717)가 장착된    HPLC를 이용하여 분석하였다. 이동상은 acetonitrile/water(60:40 v/v)을 사용하였으며 naphthalene을 internal standard로써 사용하였다. 시료 전처리는 배양액에 aceto-nitrile을 1:1(v/v)의 비로 넣어 vortex mixers(Thermolyne, M37615)로 1분동안 mixing후 3000rpm에서 15분동안 원심분리하여 상등액을 0.45□ filter(Millex-HV)로 여과시킨 후 분석 전까지 -20℃에 보관하였다.

결과 및 토론

Na2SO4(0.1%)가 dibenzothiophene powder(0.1%)가 각각 황원으로 들어간 BSM에서 세포의 성장 상태를 알아보기 위해 Nutrient broth에서 배양한 결과와 비교하였다.(Fig 1) 그림에서 알 수 있듯이 Na2SO4가 황원으로 들어간 것은 거의 동일한 성장 경로를 보여 주었으나 dibenzothiophene powder가 황원으로 첨가된 경우는 성장이 둔화되었음을 관찰하였다. 이 균주는 doubling time이 12시간이었다. 또한 세포 건조 중량과 OD와의 관계가 DCW=0.4687·OD+0.1074였으며 CFU와 OD와의 관계도 CFU(cells/ml)=1.5E8·OD이었다. 배지에 DBT를 효과적으로 분산시키기 위한 하나의 방법이 DBT를 solvent에 녹인 후 배지에 넣는 것인데 이때 solvent의 특성은 물과 잘 섞여야 하고 세포에 독성으로 작용하지 말아야 한다. Dimethylfo-rmamide는 위 조건에 잘 맞는 solvent였다. Dimethylformamide가 세포성장에 끼치는 영향을 알아보기 위해 농도를 달리하여 세포 성장을 알아 보았다.(Fig 2) 그림에서 보듯 2%의 농도는 세포성장을 둔화시키거나 저해를 주지않았으나 4%이상에서는 성장이 둔화되거나 아예 성장을 보이지 않았다. Fig. 3은 수용액상에서 탈황실험을 행한 결과이다. 초기 OD값은 0.1이었으며 10일후의 OD값은 약 1이었다. 그리고, 2-hydroxybiphenyl은 처음 2일간은 출현하지 않다가 계속 증가하는 거동을 보이고 있으며 10일후에는 10ppm이 DBT에서 HBP로 전환되었다. 게재되지는 않았지만 hexadecane을 oil로 사용하여 세포 배양시 유화도를 측정한 실험에서 특징적인 것은 황원으로 sulfate를 제외시켜 세포의 성장을 억제시킨 것은 유화도가 낮았던 반면 sulfate를 첨가시킨 배양액의 유화도는 상당히 높은 것을 관찰할 수 있었다. 이것은 아마도 세포가 surfactant를 분비하여 oil을 에멀젼화시키기 때문인 것 같다. 이러한 세포의 특성을 이용하면 oil속에 DBT가 존재할 때 세포와 DBT간의 접촉면적을 상당히 크게 제공해 주기 때문에 탈황효율을 증대시켜 줄 것으로 기대된다.                                                                                                                                     참고문헌

1. Finnerty, W. R., Robinson, M., Microbial Desulfurization of Fossil Fuels :  A Re-    view, Biotech. Bioengin. Symp. 16, 205-221, 1986.                             2. Malik, K. A., Microbial removal of organic sulfur from crude oil and the environ-    ment: Some new perspectives, Process Biochemisty. 13, 10-12, 1978.            3. J.J. Kilban, US Patent 5,104,801                                           4. Izumi, Y., Ohshiro, T., Ogino, H., Hine, Y., Shimao, M., Selective Desulfurization     of Debenzothiophene by Rhodococcus erythropolis D-1, Appl. Environ. Microbiol.     60, 1, 223-226, 1994.                                                      5. Denome, S. A., Olson. E. S., and Young, K. D., Identification and Cloning of       Genes Involved in Specific Desulfurization of Dibenzothiophene by Rhodococcus      sp. Strain IGTS8, Appl. Environ. Microbiol. 59(9), 2837-2843, 1993.