역상 액체 크로마토그래피에서 Deoxyribonucleoside를  분리하기 위한

최적 용매 조성 및 Step-Gradient 방법

이 종 호, 이 주 원, 노 경 호

인하대학교, 화학공학과

Optimum Gradient Mode for Deoxyribonucleosides in RP-HPLC

Chong Ho Lee,  Ju Weon Lee, Kyung Ho Row

Dept. of Chem. Eng., Inha University

서 론

데옥시뉴클레오사이드는 DNA의 구성요소로서 천연적으로 존재하는 뉴클레오사이드는 넓은 범위의 생물학적 효능을 지니고 있어 많은 뉴클레오사이드의 유도체는 이미 항생제와 항암제로서의 잠재력을 인정받고 있다. 특히, 5-triphosphate 유도체는 HIV 감염 대해 중요한 물질로 주목 받고 있다. 이런 의미에서 전구체로서 순수한 뉴클레오사이드를 얻는 것은 매우 중요하다.

액체 크로마토그래피를 이용한 생화학적 물질의 분리에 대한 관심이 높아짐에 따라서 분리의 최적화를 이루는 실질적인 문제에 대해서 관심의 초점이 모아지고 있다. 최적화 대상은 물질의 분리도, 분리시간, 최대의 분리가 가능한 양이다. 물질의 분리도는 두 인접 피크간의 체류시간의 차이와 기준선에서 피크의 평균 폭에 의해서 정의된다. 분리도를 크게 하기 위해서는 column 내에서의 체류시간의 차이가 분명히 존재하여야 한다. 분리도는 가장 우선 다루어져야 하고 이를 위해서 이동상의 종류와 조성에 대한 최적화가 이루어져야 한다. 체류시간 대신에 dead time을 고려한 체류인자(retention factor)를 사용하여 분리도를 표시한다. 이동상의 최적화는 실험에 의하여 결정하거나 체류시간에 대한 수학적 모델식에 의하여 이루어지게 된다. 전자는 최소한의 실험으로부터 이동상의 조성을 얻기 위하여 통계적인 방법, 다양한 함수(주로 다항식)의 형태로 표시하는 방법이 사용된다. 후자는 체류인자와 이동상에 대한 체류 메카니즘에 대한 모델식을 이용하는 방법[1,2]으로 이동상의 조성에 대한 최적화뿐만 아니라 쉽게 적용할 수 있는 방법이다. 또한, 이동상의 조성을 변화시키는 구배용매조성법(gradient mode)은 일정용매조성법(isocratic mode)에 비해서 짧은 분리시간, 보다 향상된 분리도, tailing이 작은 피크 등의 장점이 있다.

본 연구에서는 계단함수의 구배용매조성법에서 체류부피를 예측하기 위해서 실험적으로 체류인자를 가장 잘 예측하는 quadratic equation을 사용하여 체류인자와 이동상 조성의 관계식을 구하고 분리도와 분리시간을 기준으로 최적 이동상의 조건과 구배시간을 계산하였다. 또한 단이론을 적용하여 용출곡선을 구하였다.

최적화 방법

다섯 개의 deoxyribonucleosides를 분리하기 위한 이동상의 조성은 물과 메탄올의 이성분계를 사용하였다. 각 성분에 대한 체류인자와 이동상의 조성에 대한 관계는 실험적으로 구하였다 [3]. 고정상과 이동상 내에서의 물질의 체류에 관한 모델은 Snyder의 log관계식과 Langmuir 흡착으로부터 얻은 식 등이 있으며 이 중에서 가장 실험식과 잘 일치하는 quadratic equation을 사용하였다.

[eqn: ln k'=A cdot F^2 +B cdot F+ C]	(1)

A, B, C는 실험상수이고 k', F는 각각 체류인자와 이동상 내에 포함된 유기용매(메탄올)의 부피분율이다. 이성분계 조성에 따른 체류인자의 값으로부터 각 물질에 대한 체류인자를 식 (1)에 의하여 회귀분석하여 실험상수를 구하였고 상관계수가 1에 근사하였다. 식 (1)은 역상뿐만 아니라 정상 액체크로마토그래피에서도 적용할수있고 이동상의 조성이 삼성분계인 경우에서도 두 개의 실험상수를 추가하여 사용할 수 있다 [2].

본 최적화 방법은 구배용매조성법중 이동상이 계단함수(step function)로 변하는 경우로 이때의 체류부피(VRg)는 다음과 같다[4].

[eqn: V_Rg = V_m {(1+k'_2 ) + V_g,1 over k'_1 (k'_1 -k'_2 )}]	(2)

k'1, k'2는 각기 첫 번째와 두 번째 이동상에서의 체류인자이고 식 (1)에 의해 계산된 값을 사용하였다. Vg,1은 구배부피(gradient volumn)로 시료를 주입한 후 두 번째 이동상이 column에 들어가기 시작할 때까지 첫 번째 이동상이 column의 입구를 통과한 부피이다. 따라서 계단함수인 경우, 체류인자는 다음식으로 계산할 수 있다.

[eqn: k'_g = {V_Rg -V_m}over V_m]	(3)

k'g는 구배용매조성법후의 체류인자이다.

단이론에 의하면 각 단과 단 사이의 물질수지식으로부터 결과식은 다음과 같다[2]

[eqn: c_N = c_0 SUM from { { i}=N-r} to N-1 {(aV)^i}over i! e^-aV]	(4)

cN은 N단에서 물질의 농도이고 c0는 주입한 물질의 농도이다.  (4)를 사용하여 임의의 이동상의 조성과 구배용매조성하에서 각 물질에 대한 농도분포곡선을 예측할 수 있다.  위의 식에서 a는 다음과 같다.

[eqn: a= 1 over {v_m +Kv_s}]	(5)

고정상의 부피(vs)에 대한 이동상의 부피(vm)의 비율을 b로 나타내면 평형상수(K)와 체류인자의 관계식은 다음과 같다. 상용화된 analytical column에서는 공간율이 0.75이기 때문에 b는 3으로 하였다.

[eqn: K=bk']	(6)

이론단수는 일정용매법과 구배용매조성법의 실험에 의하여 체류시간(tR)과 기준에서의 peak의 폭(w)을 측정하고 다음식에 의해서 계산하였다.

N = 16 (tR/w)2	(7)

물질(1,2)간의 분리도는 다음과 같이 정의된다.

R12 = 2(tR1 - tR2)/(w1 + w2)

이성분계 이동상의 조건에서 체류시간은 식 (2)에 의해서, 폭은 식 (7)에 의해서 구하여 각 물질간에 가장 좋은 분리도를 얻었다. 첫 번째와 두 번째 이동상의 조성은 0 - 35%의 메탄올을 포함하는 물이며 이를 1%씩, 구배시간은 1분씩 증가시키면서 계산하여 최적조건을 구하였다. 계산과정은 Mathematica (Ver.2.2)를 Pentium PC에서 수행하였다.

결과 및 고찰

크로마토그래피는 각 물질이 고정상과 이동상에서의 농도비가 다르기 때문에 분리가 된다. 즉 평형상수는 가장 중요한 매개변수이고 체류인자와는 식 (4)에서 보는 바와 같이 두상에서의 부피비를 곱하여 표시되며 이 값은 충진물의 직경이 10 □이하의 분석용 column에서는 일정한 값을 갖는다. 선형 흡착평형식을 가정한 단이론에서는 비교적 주입양이 작은 경우 계산된 농도분포곡선과 실험값이 잘 일치하지만 체류인자는 이동상의 조성에 의하여 크게 변하기 때문에 정확한 함수관계를 제시하여야 이동상의 조성에 대한 최적화가 가능하게 된다. 식 (1)는 이러한 목적에 부합하며, 식 (2)에 의하여 계단함수의 구배용매조성법에서 체류부피를 계산하여 사용하는 것이 본 연구의 최적화 방법이다.

일정용매조성법에서 이동상의 조성을 최적화한 결과를 Fig. 1에 나타냈다. 용출순서는 dCyd, dUrd, dGuo, dThd, dAdo이고 17%의 메탄올을 포함하는 이동상으로 각 물질간의 분리도는 dCyd와 dUrd는 1.39, dUrd와 dGuo는 5.64, dGuo와 dThd는 1.42, dThd와 dAdo는 7.60이고 가장 늦게 용출되는 dAdo의 체류시간은 11.25분이다. Dead time은 2.7 분으로 하였다[3].

유기용매인 메탄올의 조성과 구배용매조성법에서의 최적화된 결과는 첫 번째 이동상의 조성을 12%의 메탄올로 사용하고 구배시간인 7분 후에 계단함수로 두 번째 이동상의 조성을 35%의 메탄올을 포함하는 이동상으로 변하게 하는 조건이며 크로마토그램을 Fig. 2에 나타냈다. 각 물질의 분리도는 위와 같은 순서로 2.63, 8.26, 1.56, 3.46이고 분리시간은 10.6분 이내에 분리가 되었다. 계단함수의 구배용매조성법을 적용할 경우 일정용매조성법에 비해서 dThd와 dAdo의 분리도가 4.14 감소함므로써 분리시간 단축되었다. 특히, 분리도가 1.5이하인 dCyd와 dUrd 그리고 dGuo와 dThd의 분리도가 1.5 이상이 됨에 따라 5가지의 데옥시리보뉴클레오사이드가 12분내에 모두 기준선에서 분리되었다.

이 방법을 사용하여 이동상 조성 및 구배시간을 계산할 수 있기 때문에 분석용 뿐만 아니라 제조용 크로마토그래피 공정에 이용될 예정이다. 이동상의 조성에 따른 체류인자의 data를 실험적으로 최소한 3개를 얻어 식 (1)의 실험상수를 구할 수 있고 구배용매조성법과 단이론을 적용할 수 있는 것이 본 최적화 방법의 특징이다. 물질을 분리하기 위한 최적 이동상의 조성과 구배시간을 실험적으로 구하기 위해서는 많은 실험을 시행오차적으로 수행하여야 된다. 그러나 이동상의 조성에 따른 체류인자를 식 (1)에 의한 이동상 조성의 함수로 나타내고 계단함수인 경우 단이론에 의하여 용출곡선을 예측할 수 있다. 따라서 실험횟수를 크게 줄일 수 있기 때문에 신속하게 최적 분리조건을 얻을 수 있다.

참고문헌

1. 이 주 원, 노 경 호 : 화학공학, 35, 769 (1997).

2. 이 주 원, 노 경 호 : 공업화학, 8, 694 (1997).

3. 이 주 원, 노 경 호 : 화학공학, 36(2) (1998).

4.  Markowski, W. and Gotkiewicz, W. : Chromatographia, 25, 4, 339 (1988).

알림

본 연구는 과학재단(Grant No. 971-1107-048-2)의 연구비 지원에 의하여 고순도 분리 연구실에서 수행되었습니다.

Fig. 1. Elution profile of deoxyribonucleosides in isocratic mode.

(water/MeOH = 83/17, vol. %, 1ml/min)

Fig. 2. Elution profile of deoxyribonucleosides in stepwise-gradient mode.

(1st mobile phase : water/MeOH = 88/12, vol. %,

7 min gradient time, 2nd : 65/35, vol.%, 1ml/min)