Spreadsheet을 이용한 taxol의 Langmuir 흡착평형식

박영광, 정성택, 노경호

인하대학교 화학공학과

Langmuir adsorption isotherm of taxol by spreadsheet

Young Kwang Park, Sung Taik Chung, Kyung Ho Row

Dept. of Chem. Eng., Inha University

서론

항암제로서 탁월한 성능이 임상학적으로 증명된 taxol ( Paclitaxel ) 은 taxane ring의 구조를 갖는 taxane diterpene amide이다[1]. Taxol은 세포배양, 합성법 뿐만 아니라 제한된 천연물질로부터 분리·추출되고 있는데, 주요 공급원은 주목나무로부터의 추출물을 제조용 액체 크로마토그래피의 흡착특성을 이용하여 정제하는 것이다.

본 고순도분리연구실에서는 주목나무 추출물로부터 taxol을 분리하는 연구를 정상 및 역상 액체 크로마토그래피를 이용하여 수행하였다. 실험결과로는 역상의 경우, Curosil-PFP column을 이용하여 이동상의 조성이 Water/ACN/MeOH =56/39/5 (vol.%)일때, 정상의 경우는 Nova-Pak column을 이용하여 이동상의 조성이 binary system에서는 Hexane/EtOH=96/4 (vol.%), ternary system에서는 Hexane/1-propanol/MeOH=96/2/2 (vol.%)에서 taxol을 분리할 수 있었다[2,3]. 역상에서의 실험 결과로부터 분리도와 이동상조성의 관계를 나타내는 실험상관식을 구하였고 이 실험상관식으로부터 이동상의 최적범위를 분리도와 분리시간을 기준으로 정하고 실제 실험에 적용하여 실제 주목나무 추출물에서 taxol을 분리하는데 이용하였다[3]. 주목나무로부터 taxol을 분리 정제하기 위하여 용매를 사용하여 추출하고 분배과정을 거쳐 농축하였고, 농축액에 잔존하는 lipid, pigment등의 불순물을 제거하기 위해서 전처리 단계에서 open column을 사용하였다. Open column에서는 silica를 충진하였고 이동상의 조성을 조합하며 실험하였다. 실험결과에 의하면 MC/acetone의 이성분계에서 97/3에서 75/25 (vol/%)의 구배용매 조성법에서 용출시간이 빠르고 색층의 구별이 명확하였다[4].

크로마토그래피 내에서 흡착되는 물질과 흡착제와의 상관관계를 나타내는 흡착평형식을 계산하는 과정은 제조용 분리공정에서는 매우 중요하다. 본 연구에서는 주목나무의 추출물로부터 얻어진 순수한 taxol을 제조용 규모의 액체 크로마토그래피에서 분리하여 taxol 및 cephalomannine의 흡착평형식을 spreadsheet을 이용하여 Langmuir adsorption isotherm으로부터 구하는 것이다.

이론적 배경

흡착공정에서 흡착속도와 탈착속도가 동일한 동적평형중에 있는 흡착계를 가정하여 흡착제와 고정상에 흡착되는 흡착량과의 관계를 나타낼 수 있다.

[eqn: C sub s = {C sub M q sub m} over {C sub M + k sub D} = {C sub m q sub m k sub A} over {C sub m k sub A + 1}]                  (1)

위 식은 흡착되는 용질의 농도와 고정상에 흡착되는 흡착량과의 상관관계를 나타낸다. qm(monolayer capacity)값은 langmuir isotherm식으로 유도되어 실험치로서 다음과 같이 구해진다.[5] 이때 q(많은 양의 시료를 주입할 때 고정상에 흡착되는 양), N 그리고 k'은 고농도에서 측정된 값이고 k'low는 저농도에서 측정된 값이다.

[eqn: q sub m = q root{2N} k sup ' over { 1 + k sup '} k sub low sup ' over {k sub low sup ' - k sup'}]                   (2)

(1)식에서 사용된 상수들의 물리적인 의미는 다음과 같다.

[eqn: K sub D = k' V sub M over V sub s]                          (3)

크로마토그래피내에서 이루어지는 흡착과정을 단순화시키면 다음과 같은 형태의 식으로 표현할 수 있다.

[eqn: S(aq) + L(s) ↔ S-L(s)]                      (4)

(kA=k1/k2 이때 kA는 association 상수, k1,k2는 각각 정,역반응 속도상수이다.)

[eqn: k sub A = {[S-L sup * ]}over{[S sup * ][L sup * ]} = q sup * over {C sup * (q sub m - q sup * )}]                 (5)

kA는 위 식과 같이 나타낼 수 있고 C*는 이동상의 용질의 농도(CM), q*는 흡착되는 용질의 농도(Cs)이다. 이때 Cs≪qm일 때 다음과 같은 식으로 정리될 수 있다.

[eqn: k sub A = 1 over k sub D = K sub D over q sub m]                        (6)

위 식들로부터 얻어진 값들은 이후 spreadsheet을 이용한 isotherm 그래프를 사용하는데 사용되어졌다.

실험

2.1. 시약

본 실험에 사용된 taxane의 표준시료( taxol, cephalomannine, 10 - deacetyltaxol)는 NCI ( National Cancer Institute, Bethesda, USA )에서 제공하였다. 이동상으로는 J. T. Baker 사의 HPLC용 hexane, 1-propanol, MeOH을 감압 펌프(Division of Millipore, Waters)와 필터(FH-0.5□, Waters co.)를 이용하여 감압 여과한 후에 사용하였다. 추출은 임목육종연구소에서 제공한 주목나무 분말을 사용하였다. 완전히 건조한 분말 10 g에 methanol 1□로 24시간동안 추출한 후, 추출액을 농축하기 위해 methylene chloride(MC)로 분배하였다. 추출액 125 □에 methylene chloride 100 □와 물 100 □를 혼합하여 30분간 교반한 후 분별깔대기에서 10시간이상 침강시켰다. 이 공정을 두 번 반복하여 분별깔대기의 하부층(100 □)을 분취하여 회전식 증발기(rotary evaporator, LABO-THERM SW 200, Resona Technics Co.)에서 syrup이 될 때까지 농축한다. 이 syrup을 다시 감압식 오븐에서 24시간동안 넣어두고 용매를 완전히 증발시키고, 메탄올을 가하여 100 ppm 시료를 만들었다.

주목나무 추출물에 존재하는 lipid, chlorophyl, pigment 등의 불순물을 제거하는 전처리 공정을 수행하였고 이는 이후 공정인 크로마토그래피에서 taxol을 보다 쉽고 많은 양을 분리할 수 있게 한다.

2.2. 기기 및 장치

HPLC는 Waters사의 600E 펌프(multisolvent delivery system), 486 UV-visible tunable wavelength absorbance, U6K 주입기(2□ sample loop)를 사용하였다. 데이터 저장 시스템은 CHROMATE(v.3.0, Interface Eng.)를 사용하였다. 본 실험에서는 제조용 규모의 column (250×22mm)에 Lichrospher Si 60, 15□의 packing을 충진하여 사용하였고 isotherm 실험에서는 Lichrospher Si 60, 15□의 packing을 column (300×3.9mm)에 충진하여 실험하였다. 분석 후 얻어진 시료를 농축하기 위해 회전식 증발기(LABO-THERM SW 200, Resona Technics Co.)를 사용하였다. 이동상은 hexane, IPA, MeOH를 혼합하여 사용하였다. 시료 주입량은 25 □∼2 □이고, 유속은 1.5∼16□/min으로 조정하며 일정용매 조성법에서 실험을 하였다. UV 검지는 228 nm에서 고정하였다.

결과 및 토론

Figure 1에서 주목나무 추출물로부터 분리한 taxol을 사용하여 sample size의 증가에 따른 peak 모양의 변화를 보여주고 있다. 이동상 조성은 hexane/ IPA/MeOH=90/4/6 (vol. %)에서 일정조성용매법으로 실험하였고 smaple size가 증가함에 따라 peak 모양이 Gausian type에서 직각 삼각형으로 변하는 전형적인 Langmuir 흡착평형식을 보여주고 있다. 식 (2)에 의해 qm을 구하고, 작은 양에서의 체류시간으로부터 KD를 얻을 수 있다. 식 (6)에서의  kA를 알기 때문에 식(1)에 의하여 taxol에 대한 Langmuir isotherm은 다음과 같다.

[eqn: C sub s = {53.58 C sub m} over {1 + 2.01 C sub m}]

Taxol의 Cm과 Cs의 관계는 Fig. 2에서 보여주고 있다.

알림

본 연구는 교육부 생물화학공학 분야연구과제로 수행 중인 project(과제번호 C-6)입니다

참고문헌

1. M. C. Wani, H. L. Taylor, M. E. Wall, P. Coggon and A.T. McPhail, J.       Am.Chem. Soc., 93, 2325 (1971).

2. 장경곤, 노경호, 정성택, 공업화학, 8, 286 (1997).

3. 정용안, 정성택, 노경호, 화학공학, 35, 712 (1997).

4. 장경곤, 박영광, 노경호, 정성택, 화학공업과 기술, 16, 46 (1998).

5. L. R. Snyder, G. B. Cox, P. E. Antle, Chromatographia, 24, 82 (1987).

Fig. 1 Increase of sample size of taxol in NP-HPLC

(from the top : 0.03, 0.06, 0.16mg)

Fig. 2 Adsorption isotherm of taxol