녹차로부터 카테킨 화합물의 추출 및 정제

(Ⅲ) 조업조건의 확립

강 지 훈·박 영 광·정 성 택·노 경 호

인하대학교, 화학공학과

Extraction and Purification of Catechin Compounds from Green Tea

(Ⅲ) Establishment of Operating Conditions

Ji Hoon Kang·Young Kwang Park·Sung Taik Chung·Kyung Ho Row

Dept. of Chem. Eng., Inha University, Inchon 402-751, Korea

서론

최근에 차나무 재배 면적의 확대, 현대적 제차 설비에 의한 상업생산과 더불어 소비자들의 차에 대한 새로운 인식으로 인해서 전통 차문화가 부활되어 뿌리를 내리고 점차 자리를 잡아가고 있다. 녹차는 건강 증진, 신체 기능 조절면에 있어서 유용한 기호 식품으로 오랫동안 애음되어 왔다. 녹차는 Camellia 속으로 90여종이 있다. 녹차가 일반 식물에 비해 특이한 점은 카페인을 함유하고 있고 폴리페놀이 많이 들어 있어 일반 식물과는 달리 여러 가지 생리활성과 관련되고 있다[1].

녹차는 다른 식품에 비하여 특징적으로 볼 수 있는 성분은 아미노산으로는 theanine 등이 있으며[2], 또 polyphenol류가 다량 함유되어 있어 일반식물과는 달리 여러 가지 생리활성과 관련되는 것으로 알려져 있다.  Polyphenol류 중에서 카테킨 화합물은 주로 (-)epigallocatechin gallate(EGCG) 및  (-)epigallocatechin (EGC), (-)epicatechin gallate(ECG), (-)epicatechin(EC), (+)catechin(C) 등이 있다.

녹차의 생리 활성 물질인 카테킨 화합물은 추출 및 정제과정이 복잡하고 수율이 낮고 가격이 비싸다는 단점이 있어 그 성분과 생체내에서의 작용에 관련된 연구는 미비하였다. 그러나, 1980년대 이후 녹차 카테킨 화합물의 다양한 연구 결과가 보고되어 있고, 최근에는 특히 십이지장암, 결장암, 피부암, 위암, 폐암 및 유방암, 간암, 대장암 억제 효과와 식도암, 방광암, 전립선암 예방 효과 등 많은 항암작용과 치매 예방, 에이즈 바이러스 억제 및 전자파 방어효과 등이 보고되고 있어 녹차의 효능에 대한 연구개발이 활발히 진행되고 있다.

Okushio 등은 Capcell-pak C-18 AG  column을 사용하여 acetonitrile -ethylacetate-0.05% phosphoric acid aqeuous solution(12 : 2 : 86)의 이동상과 1□/min의 유속으로 UV 280nm에서 HPLC 분석을 하였고[3], 국내에서는 50℃의 물로 녹차를 추출하여 클로로포름과 에틸아세테이트로 분배한 후 □-Bondapak column을 사용하여 Water/ACN/Acetic acid=870/130/5(vol.)의 이동상과 1□/min, UV 280nm에서 RP-HPLC로 카테킨 화합물을 분리하였다[4,5]. 이와 같이, 카테킨 화합물의 추출, 분배, HPLC 분리와 효능에 관한 연구가 국외 및 국내에서 많이 진행되고 있다.

본 연구의 목적은 녹차에 많이 함유되어 있는 카테킨 화합물을 추출하기 위한 추출조건과 정제, 분석조건을 확립하고, semi-preparative HPLC로 정제를 하여 최종 물질인 EGCG를 얻는 것이다.

실험

1. 실험재료 및 기기

본 실험에 사용된 녹차는 전라남도 보성에서 1997년에 재배된 네물차(9∼10월)를 구입하여 사용하였으며, 표준시료 물질인 (±)-Catechin, (-)-Epicatechin(EC), (-)-Epigallocatechin Gallate(EGCG), (-)-Epigallocatechin, (-)-Epicatechin Gallate는 Janssen Chimica와 SIGMA에서 구입하였으며, Methanol, Acetonitrile은 ACS Grade를 국내에서 구입하였고, Water는 2차 증류한 증류수를 사용하였다.

추출한 시료를 농축하기 위해 회전식 증발기(LABO-THERM SW 200, Resona Technics Co.)를 사용하였으며, HPLC는 Waters사의 600E, 616 펌프(multisolvent delivery system), 486 UV-visible tunable wavelength absorbance, 2486 Dual □ absorbance detecter, U6K 주입기(2□ sample loop), Rheodyne 주입기(2□ sample loop)를 사용하였고, 데이터 저장 시스템(data acquisition system)은 Chromate(ver. 3.0, Interface Eng.)와 Millennium32(Waters)를 사용하였다.

2. 추출, 정제 및 분석

국내에서 재배된 녹차 5g에 순수한 물 150□를 넣고 조업온도, 교반속도, 침적시간에 변화를 주면서 교반기에서 교반하여 추출을 하였다. 추출이 끝난 추출액은 10분동안 원심분리(4000rpm)한 후, 여과하여 rotary evaporator를 사용하여 60℃이하에서 농축하였다.

정제는 semi-preparative HPLC를 이용하였고, column은 제조용 충전물이 채워진 column(250×4.60□)을 사용하였다. Mobile phase는 0.1% Acetic acid in Water/ACN=87/13(vol.%), flow rate 1.0□/min, detecter UV 280nm, injection volume 15□로 추출액중에서 EGCG를 정제하여 농축하였다.

분석은 RP-HPLC를 이용하였고, column은 분석용 □-Bondapak(3.9×300mm, 10□) column을 사용하였다. □-Bondapak column은 mobile phase로 0.1% Acetic acid in Water/ACN=87/13(vol.%), flow rate 1.0□/min, detecter UV 280nm, injection volume 20□로 농축액을 분석하였다.

결과 및 고찰

녹차에 함유되어 있는 카테킨 화합물을 추출하기 위하여 순수한 물에 대해서 조업온도, 교반속도, 침적시간을 변화하면서 추출실험을 하였다. Table 1은 조업온도에 대한 카테킨 화합물의 양을 측정한 결과이다. 순수한 물은 50℃일 때 가장 우수하였고, 온도가 증가할수록 카테킨 화합물의 양이 감소하였다. Table 1에 의하면 가장 좋은 추출조건은 순수한 물 50℃였다.

Table 1. Amount of EGCG with operating temperature

(agitation rate : 300rpm, dipping time : 4 hour)

Operating temperature	Peak Area(containing EGCG)
30℃	58,139,650
50℃	87,102,022
70℃	46,452,004
90℃	37,277,074

Table 2, 3은 순수한 물 50℃일 때 교반속도와 침적시간에 대한 카테킨 화합물의 양을 측정한 결과이다. 교반속도는 300rpm일 때 가장 우수하였고, 4시간 동안 침적하였을 때 카테킨 화합물을 가장 많이 추출할 수 있었다.

Table 2. Amount of EGCG with agitation rate

(operation temperate : 50℃, dipping time : 4 hour)

Agitation rate	Peak Area(containing EGCG)
100rpm	74,261,006
300rpm	87,102,022
500rpm	77,321,113
700rpm	73,092,168

Table 3. Amount of EGCG with dipping time

(operating temperate : 50℃, agitation rate : 300rpm)

Dipping time	Peak Area(containing EGCG)
2 hour	80,476,529
4 hour	87,102,022
6 hour	78,430,650
8 hour	69,869,236

위의 결과에 따라 녹차로부터 카테킨 화합물을 추출하는 가장 좋은 조건은 순수한 물 50℃에서 300rpm으로 교반하면서 4시간동안 추출하는 것이고, 제조용 충전물이 채워진 column을 이용하여 이 추출물을 분배한 후 분석한 결과가 Figure 1에 나타나있다. 이동상의 조성은 0.1% Acetic acid in Water/ACN =87/13(vol.%)이었다.

Figure 2는 semi-preparative HPLC에서 정제과정을 거쳐 농축시킨 후 RP-HPLC로  분석한 결과이다. 이동상의 조성은 0.1% Acetic acid in Water/ACN=87/13(vol.%)이고 유량은 1.0□/min이었고, 건조된 녹차잎 5g으로부터 목적물질인 EGCG 1.178□을 얻을 수 있었다.

알림

본 연구는 과학재단 핵심전문연구(과제번호 : 981-1102-006-2)의 지원에 의하여 고순도 분리 연구실에서 수행되었으며, 이에 감사드립니다.

참고문헌

1. 정용안, 노경호 : 정밀화학, 47, 16(1998).

2. Sagesaka, Y., Kakuda, T. and Kawamura, K. : Proceedings of the              International Symposium on Tea Science(Japan), 362(1991).

3. Okushio, K., Matsumoto, N., Kohri, T., Suzuki, M., Nanjo F. and Hara, Y. :     Biol. Pharm. Bull., 19(2), 326(1996).

4. 강지훈, 정성택, 노경호 : 화학공학의 이론과 응용, 4(1), 1177(1998).

5. 강지훈, 박영광, 정성택, 노경호 : 한국공업화학회 춘계 논문발표, 181(1998).

Fig. 1. Preparative separation of Catechin compounds from Green Tea

(0.1% Acetic acid in Water/ACN=87/13(vol.%), 1.0□/min,

15□ injection volume)

Fig. 2. Analysis of EGCG from Green Tea by □-Bondapak column

(0.1% Acetic acid in Water/ACN=87/13(vol.%),  1.0□/min,

20□ injection volume)