초임계 CO2내에서의

Cyclodextrin Glucanotransferase의 작용 Mechanism

고 은용, 박 창렬*, 유 연우*, 김 철

아주대학교 화학공학과, 아주대학교 생물공학과*

A study on the Kinetic Mechanism of Cyclodextrin Glucanotransferase

in Supercritical Carbon Dioxide

Eun Yong Ko, Chang Yeol Park, Yeon Woo Ryu* and Chul Kim

Department of Chemical Engineering and Department of Biotechnology*, College of Engineering, Ajou University, Suwon 442-749, Korea.

서 론

Cyclodextrin은 amylase 계통의 효소인 cyclodextrin glucanotransferase (CGTase)를 전분에 작용시켜 glucose 분자가 □-1,4-glucoside 결합에 의해 환상으로 연결된 비환원성의 malto oligosaccharide로 glucose 분자 수에 따라 □(6개)-, □(7개)-, □(8개)-cyclodextrin의 세 종류로 구분된다. Cyclodextrin 분자중의 동공이 소수성을 외부가 침수성을 나타내는 특이한 분자 구조를 나타내서 분자 내부에 여러 가지 유용한 유기, 무기 화합물질을 포접하여 휘발성 물질의 안정화, 산화방지, 광분해 물질의 보호, 용해도의 향상과 같은 여러 가지 물질 개선 효과가 있어서 식품, 의약품, 농약 등 다방면에 유용하게 활용할 수 있는 기능성 탄수화물계 생물 신소재이다[1-3].

초임계 유체는 기체상과 같은 낮은 점성과 높은 확산성으로 기질에서 효소로의 물질전달 속도를 높여 주고, 액체상과 같은 밀도로 기체상에서 관찰된 것보다 더 높은 용해도를 가진다. 일반적인 전분의 효소가수분해 반응은 반응시간이 길며 이차산물에 의한 환경오염문제를 야기하고 있으며 경제적인 측면에서도 고온조작등으로 인한 손실이 있다[4-5].

본 연구에서는 초임계 이산화탄소내에서 enzyme(CGTase)의 최적 조건과 작용 기작을 결정하고, 특히 생성물에 포함되는 □-, □-, 그리고 □-cyclodextrin 각 product의 inhibition mechanism을 초임계 이산화탄소와 상압하에서 실험을 수행하여 비교 검토하였다.

실 험

1. 시약 및 장치

Starch는 Sigma사(U.S.A)의 99% 순도를 가진 Potato starch를 사용하였으며, product inhibition mechanism 실험을 위한 효소(CGTase)는 NOVO co.의 3.0 KNU/ML의 활성도를 가진 THORUZYME(Batch no.:ACN 00019)을 사용하였다. 그리고 inhibitor로는 SIGMA사(USA)의 □-, □-, 그리고 □-cyclodextrin을 사용하였다. 실험 장치는 Figure 1에 나타낸 바와 같이 이산화탄소 주입부, 교반 반응기 및 시료 채취부로 구성되어 있다. 온도 조절기가 달린 교반 항온 수조를 이용하여 반응기의 온도를 조절하였고, 반응기 내부에 삽입된 thermocouple로 온도를 측정, ±0.5℃ 이내의 오차범위에서 온도를 일정하게 유지시켜 주었다. 상압에서와 초임계 이산화탄소내에서의 반응을 위한 반응기는 동일한 반응기를 사용하여 실험을 수행하였다.

12

PG

7   TG

3	8	11

2	4

TG

8

5

6	9

1

10

9

Fig. 1 Schematic diagram of experimental apparatus.

1. CO2 bomb	7. Pressure indicator

2. Liquid pump	8. Thermocouple

3. CO2 input line	9. Temperature indicator

4. Back pressure regulator	10. Digital stirring bath

5. Reactor	11. Sampling valve

6. Magnetic bar	12. Purge valve

2. 실험 방법

CGTase와 0.1M sodium acetate buffer solution(pH 5.0)을 혼합한 enzyme solution(2mL/L)에 starch를 50g/L가 되게 한 후에 enzyme(CGTase)의 최적온도인 70℃에서 항온교반수조를 이용하여 enzyme(CGTase)에 의한 starch의 cyclodextrin 생성반응을 수행, 5∼10분마다 시료를 채취하여 초기반응속도를 결정하기 위한 최적반응시간을 결정 실험을 수행하였다.

초임계 이산화탄소내에서의 enzyme kinetics 실험은 CGTase enzyme solution (2mL/L, pH 5.0)에 starch를 20, 25, 30, 50, 70, 100 g/L가 되도록 첨가하고 반응기를 조립, 각각의 실험을 수행하였다. 그리고, product inhibition을 알아보기 위하여 □-, □-cyclodextrin은 0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5 g/L 그리고 □-cyclodextrin은 0.25, 0.5, 0.75, 1.0 g/L로 각각의 기질농도에 첨가하여 실험을 수행하였다. 반응기의 온도와 압력이 최적 반응압력과 온도에 평형이 된 후 15분 후에 시료를 채취하여 얼음물에 1분간 처리하여 HPLC 분석 전까지 freezer에 냉동 보관하였다.

결과 및 토론

Figure 2와 figure 3은 enzyme 반응 최적 pH와 최적 온도를 결정하기 위한 것으로써 최적 pH는 5.0이고, 최적 온도는 70℃로 결정하였다.

Figure 4는 기질을 20 g/L로 하였을때, 시간에 따른 cyclodextrin의 생성곡선으로써 반응시간이 15분까지 linear 하였으므로 초기반응속도를 결정하기 위한 반응시간을 15분으로 하였다.

상압과 초임계 이산화탄소내에서 starch를 기질로 하여 enzyme(CGTase) 반응을 시켜서 초기 반응 속도를 구한 후 Lineweaver-Burk plot하여 각각의 product들에 대한 enzyme(CGTase)의 활성 억제 작용에 대해서 규명하였다. 그리고 상압과 초임계 이산화탄소내에서 □-, □-, 그리고 □-cyclodextrin에 대한 반응 속도 상수들을 구하여 서로 비교 검토하고, starch를 enzyme(CGTase) 반응 시켜서 생성되는 cyclodextrin의 생성량에 미치는 각각의 product들의 영향을 규명하였다.

참고 문헌

1. Cramer, F. (1987) Cyclodextrins and their industrial uses ; Duchene, D., Ed. P. 11, Editions de Sante, Paris.

2. French, D. (1957) The Schardinger dextrins. Adv. Carbohydr. Chem. 12:189-260

3. Szejtli, J.(1982) Cyclodextrins and their inclusion complexes. Akademiai  Kiado, Budapest.

4. Lee, Y.H., S.G. Baek, H.Y. Shin, and D.C. Park(1993), Kor. J. Appl. Microbiol. Biotechol. 21,(5) 447-461.

5. Nakamura, K.(1990), Biochemical reactions in supercritical fluids, Tibtech, 8, 288-292.

6. K. C. Patrick Lee and Bernard Y. Tao(1995), A kinetic study of cyclodextrin glycosyltransferase: substrate and product inhibitions, Biotechnol. Appl. Biochem. 21, 111-121.

Figure 2. Effect of temperature on the CGTase      Figure 3. Effect of pH on the CGTase.

in atmospheric condition.	(0.1M sodium acetate)

Figure 4. Enzymatic synthesis of  cyclodextrins

in atmospheric condition.