클로람페니콜과 자외선이 Streptomyces albulus균의

폴리리신 생산에 미치는 영향

안치민□선흥석□정흥조*□박찬영

전남대학교 공과대학 응용화학공학부, 서남대학교 화학공학과*

The influence of chloramphenicol and ultraviolet on the polylysine production of Streptomyces albulus

Chi-Min Ahn□Heung-Suk Sun□Heung-Joe Jung*□Chan-Young Park

Faculty of Applied Chemical Engineering College of Engineering, Chonnam National University, Dept. of Chemical Engineering, Seonam University*

서론

Streptomyces는 방선균으로서 여러 가지 항생물질을 만드는 것으로 알려져 있다. Shima 등[1]은 토양미생물에서 □-Poly-L-Lysine(□-PL)을 만들어내는 Streptomyces albulus(S. albulus)종을 찾아내었다. □-PL은 25∼30개의 리신(lysine)단량체가 균일하게 결합된 선형중합체물질(linear homopolymer)이며, 250℃까지 열에 대해서 안정한 물질이다[2]. 그람(Gram)양성 균과 음성 균에 대한 최소저지농도는  1∼8□/□였다[3]. 폴리리신은 약물 전달용 담체나 동물세포 접착제에 이용되고있으며[4], 일본에서는 여러가지 가공식품 보존제로 각광받고 있다[5]. 이러한 항균력이 뛰어난 폴리리신의 이용은 식품산업 및 의료용 재료 등에 더욱 폭넓게 응용되리라 기대된다. 현재 일본의 Hiraki 등[8]은 이 균주를 돌연변이 시켜서 폴리리신의 생산성을 원래 균주보다 20배 이상 증가시켰다고 보고하였다. 그리고 Sun 등[9]은 전기충격과 화학적 돌연변이원인 NTG(N-methyl-N'-Nitro-N-Nitrosoguanidine)를 병행하여서 방선균의 포자와 효모세포에 대한 치사율과 영양요구 돌연변이주 생성율을 증가시켰다고 보고하였다. 따라서 본 연구에서는 S. albulus균의 성장과 폴리리신 생산에 미치는 클로람페니콜과 자외선의 영향을 조사하였다. Hiraki 등[8]은 S. albulus균을 화학적 돌연변이만을 시켰는데, 본 실험에서는 자외선을 이용하여 폴리리신 생산량의 변화를 조사해 보았다. 그리고 폴리리신 생산량 증대를 위해서 자외선과 클로람페니콜을 병행하는 방법을 모색하고자 한다.

실험

본 실험에 사용한 균주는 Streptomyces albulus spp. lysinopolymerus로 일본국립생명공학연구소(National Institute of Bioscience and Human technology, NIBH, Tsukuba, Japan)에서 분양 받아 사용하였으며, 배양온도는 모든 경우에 30℃를 유지하였고 배양은 130rpm으로 조정된 진탕배양기(Shaking Incubator, KMC-8480S, Vision Science Co., Ltd.)안에서 행하였다. 배양에 사용한 배지는 Shima 등[1]이 제시한 배지를 사용하였으며, 그 성분은 6.8로 조정한 0.02M [eqn: rm KH_2 PO_4]-[eqn: rm Na_2 HPO_4]완충용액에 Glycerol 5%, [eqn: rm (NH_4 )_2 SO_4] 1%, Yeast extract 0.5,[eqn: rm MgSO_4 CDOT 7H_2 O] 0.05%, [eqn: rm FeSO_4 CDOT 7H_2 O] 0.003%,[eqn: rm ZnSO_4 CDOT 7H_2 O] 0.004%이다.

화학돌연변이 유발 실험

화학돌연변이 유발 원으로는 항생제인 클로람페니콜을 사용하였다. 화학돌연변이 유발 실험은 먼저  250□플라스크 4개를 준비한 후 각 플라스크에 □Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ,Ⅳ□로 표시한 다음 배지를 40□씩 채워 멸균하였다. 액체 배지에서 38시간동안 성장한 균을 준비해 놓은 각 플라스크 안의 배지에 접종한 다음 Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ,Ⅳ 각 플라스크 안의 배지에 클로람페니콜 양을 다르게 하여 1□씩 첨가하였으며, 그 첨가량은 0□/□, 10□/□, 50□/□, 100□/□이다. 클로람페니콜이 첨가된 배지에 균을 55시간동안 진탕 배양한 후 각 플라스크에서 50□씩 취하여 순서대로 고체배지에 도말 하여 30℃로 조정된 항온기(Incubator, Model 2930, Dong Yang Science Co.) 안에서 배양하였다. 항온기 안에서 65시간동안 배양한 후 각 고체배지에서 군락(colony) 2개를 백금이로 취하여 30□시험관 안의 10□배지에 접종하여 진탕배양기에서 배양하였다. 진탕배양기 안에서 36시간동안 배양한 후 각 시험관에서 1□씩 취하여 250□플라스크 안의 40□배지에 순서대로 접종하여 진탕 배양하였다. 마지막으로 30℃, 130rpm으로 조정된 진탕배양기에서 72시간동안 배양한 후 Itzhaki방법[7]으로 폴리리신의 양을 각각 측정하였다.

자외선에 의한 돌연변이 유발 실험

다양한 종류의 돌연변이 균주를 간단하고 효율적으로 얻을 수 있는 방법으로 대개 단파장의 자외선 광원을 사용한다. 본 실험에서도 자외선에 의한 돌연변이 균주를 얻고자하여 클린벤치(Clean Bench, VS-1400LS, Vision Science Co., Ltd.)안에서 자외선 등을 켜서 고체배지에 접종된 균에 시간대 별로 조사하여 액체배지에 접종 후 배양하였다. 실험의 진행은 먼저 에펜도르프 튜브에 담겨 냉동보관 중인 균 1□를 250□플라스크 안의 40□배지에 접종 후 45시간동안 배양한 다음, 미리 준비해 둔 고체배지 6개에 15□씩 접종후 삼각 유리 봉으로 도말 하였으며, □Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ,Ⅳ,Ⅴ,Ⅵ□으로 각 페트리 접시에 표기했다. 배양은 30℃로 조정된 항온기 안에서 62시간동안 배양하였으며, 돌연변이 유발을 위해 클린벤치 안에서 각 페트리 접시 뚜껑을 열어놓은 후 □Ⅰ□부터 □Ⅵ□까지 순서대로 0분, 5분, 10분, 30분, 60분 그리고 120분 동안 자외선을 조사하였다. 각각 페트리 접시에서 군락 2개씩을 취하여 30□시험관 안의 10□배지에 접종한 후 진탕배양기 안에서 64시간동안 배양하였다.

돌연변이주의 폴리리신양은 Itzhaki의 분석방법을 이용하였다[7]. 먼저 배양액을 원심 분리하여 상등액에서 2□를 취하여 1mM 메틸오렌지 2□를 넣고 약 30분 동안 실온에 방치한다. 이때 양의 하전을 띠는 폴리리신은 음이온 염색체인 메틸오렌지와 결합하여 복합체를 형성하게되며 복합체는 3000rpm으로 10분간 원심 분리하여 침전시키고 상등액을 취하여 465□ 파장에서 흡광도를 측정하였으며, Sigma사에서 구입한 폴리리신을 표준 시료로 하여 미리 작성해 놓은 보정곡선을 이용해서 시료 내에 있는 폴리리신 양을 계산하였다.

결과 및 토론

클로람페니콜 첨가량에 따른 pH변화와 폴리리신 양을 측정한 결과는 Table 1.과 같으며, 그 모습을 Fig. 1.에 나타내었다.

Table 1. The change of polylysine and pH according to adding chloramphenicol

Sample	Ⅰ	Ⅱ	Ⅲ	Ⅳ
Chloramphenicol(□/□)	0	10	50	100
pH	4.12	5.35	4.21	3.05
PL(g/□)	0.185	0.053	0.059	0.196

250□플라스크 안의 40□액체배지에 접종된 균들을 30℃, 130rpm으로 조정된 진탕배양기에서 72시간동안 배양한 후 Itzhaki방법[7]으로 폴리리신의 양을 각각 측정하였다.

클로람페니콜을 첨가해서 돌연변이 유발실험을 한 결과 클로람페니콜 양이 증가할수록 pH가 낮아졌고 100□/□ 첨가한 배지에서 균이 빨리 성장했으며 폴리리신 양도 가장 많이 나왔다.  클로람페니콜이 균의 성장과 폴리리신 생산에 영향을 줌을 알 수 있었다.

Fig. 1. The change of polylysine and pH according to adding chloramphenicol. Cultivation for 72hr in shaking incubator(30℃, 130rpm).

자외선 조사시간에 따른 pH변화와 폴리리신 양은 Table 2.와 같이 측정되었으며, 그 모습을 Fig. 2.에 나타내었다.

Table 2. The change of polylysine and pH according to the times of UV-treatment

Sample	Ⅰ	Ⅱ	Ⅲ	Ⅳ	Ⅴ	Ⅵ
UV조사시간(min)	0	5	10	30	60	120
pH	5.57	6.57	6.42	5.10	5.88	5.81
PL(g/□)	0.211	0.224	0.168	0.089	0.128	0.170

□Ⅰ,Ⅱ.Ⅲ,Ⅳ,Ⅴ,Ⅵ□번 순서대로 0분, 5분, 10분, 30분, 60분 그리고 120분 동안 자외선을 조사하였다. 각각 페트리 접시에서 군락 2개씩을 취하여 30□시험관 안의 10□배지에 접종한 후 진탕배양기 안에서 64시간동안 배양하였다.

자외선 조사를 통해 돌연변이 유발을 실험한 결과 조사시간이 가장 짧았던 □Ⅱ□번 시료에서 폴리리신이 0.224g/□로 가장 많이 나왔고, 다음으로는 대조군으로 사용했던 □Ⅰ□번에서 폴리리신이 0.211g/□가 나왔다. 자외선 조사시간에 따른 pH변화는 30분 정도까지는 빠르게 떨어지다가 60분 이상 조사된 시료에서는 pH변화가 오히려 더 느려짐을 볼 수 있었다. 따라서 자외선 조사시간이 균의 성장과 폴리리신 생산 양에 영향을 끼친다는 것을 알 수 있었다. pH가 빨리 떨어진다는 것은 균이 그만큼 빠르게 성장하고 있다고 볼 수 있으며, 균의  빠른 성장은 폴리리신을 많이 만들 것으로 기대했었다. 그런데, 이번 자외선 조사실험 결과를 비교해 볼 때, 자외선을 30분간 조사한 □Ⅲ□번 시료에서 pH가 가장 빨리 떨어졌음에도 불구하고 폴리리신양은 가장 적게 나왔고 자외선을 5분간 조사한 □Ⅰ□번 시료가 pH는 가장 늦게 떨어졌지만 폴리리신은 가장 많이 생산한 결과를 보였다.

Fig. 2. The change of polylysine and pH according to the times of UV-treatment. Cultivation for 64hr in shaking incubator(30℃, 130rpm).

화학돌연변이 및 자외선 조사에 의한 돌연변이 유발실험을 통해 다음과 같은 결론을 얻었다.

1. 클로람페니콜이 0□/□, 10□/□, 50□/□, 100□/□첨가된 배지 중에서 균을     가장 빨리 성장시키면서 폴리리신이 가장 많이 나왔던 시료는 클로람페니콜     100□/□첨가된 배지였고 폴리리신양은 약 0.2g/L였다.

2. 자외선 조사시간(0, 5, 10, 30, 60, 120분)에 따른 균의 성장과 폴리리신 생산량     의 변화를 관찰한 결과 자외선을 5분 동안 조사한 시료에서 균의 성장은 느     렸지만 폴리리신양은 0.224g/L로 가장 많이 생산하였다.

본 실험의 결과들을 통해서 폴리리신 생산량을 증대시키는 돌연변주를 얻기     위해서는 자외선 조사시간을 5분 전후로 짧게 하면서 클로람페니콜을 100□/     □이상 첨가한다면 S. albulus균을 빨리 자라게 하면서 동시에 폴리리신도 많     이 생산하는 변이 균주를 만들 수 있을 것 같다. 앞으로 좋은 변이 균주를 얻     도록 계속 보충 실험을 할려고 한다. 이러한 방법을 다른 균에도 적용해 화학     적 변이 방법과 물리적인 변이 방법의 장점들을 이용한다면 돌연변이 연구      발전에 좋은 영향을 끼치리라 기대댄다.

참고문헌

1. Shima, S. and Sakai, H.: Agric. Biol. Chem., 41(9), 1807∼1809(1977)

2. Shima, S. and Sakai, H.: Agric. Biol. Chem., 45(11), 2503∼2508(1981)

3. Shima, S., Matsuoka, H. and Iwamoto, H.: J. of Antibiotics, 37(11), 1449(1984).

4. Jacobson, B. S. and Branton, D.: Science, 195, 302(1977).

5. □井正弘: □□□□□-□□□□□□□, 32(4), 67(1993)

6. Shima, S., Oshima, S. and Sakai, H.: Nippon No^geikagaku Kaishi, 57(3),

221∼226(1983)

7. Itzhaki, R. F.: Anal. Biochem., 50, 569(1972).

8. Hiraki, J. and Morita, H.: U.S. Patent, No. 5434060(1995)

9. Sun, J. H. et al.: Kor. J. Microbiol.,Vol. 33, September, 199-202(1997)