비이온성 계면활성제를 이용한 fumarate reductase의 분리

홍정희, 강귀현, 류화원

전남대학교 생물화학공학과

Separation of Fumarate Reductase by Non-ionic Detergent

Jung-Hee Hong, Kui-Hyun Kang, Hwa-Won Ryu

Department of Biochemical Engineering

Chonnam National University, Kwangju, 500-757, Korea

서론

Fumarate reductase(FRD)는 fumarate를 succinate로의 환원반응을 촉매화하고 최종 전자수용체로서 fumarate로 대사하는 많은 혐기성 미생물의 중요효소이다(1). Fumarate를 환원시키는 능력은 그람음성박테리아와 통성의 그람양성박테리아에서 일반적인 특징이며, succinate dehydrogenase(SDH)에 의해 succinate가 fumarate로 산화되는 반응의 역반응이다.

FRD에 의해 촉매화되어 생성되는 숙신산은 고분자, 식품, 의약품 및 화장품, 1,4-butanediol 및 tetrahydrofuran의 생산에 유용하다(2, 3).

본 연구에서는 새로이 분리되어, 높은 수율로 숙신산을 생성하며, 통성의 그람양성박테리아인 Enterococcus sp. RKY1 KCTC 8890P를 혐기적으로 세포배양하여, 막에 부착되어 있는 것으로 추정되는 FRD에 효소활성을 저해시키지 않고 추출이 가능한 detergent를 처리함으로서 촉매영역의 분리를 행하였다. FRD의 형태를 제안하고 분리된 FRD에 특이적으로 반응하는 시약을 사용하여 그 특성에 대해 조사하였다.

이론

각기 다른 미생물로 부터 분리한 fumarate reductase(FRD)는 매우 다른 생물학적 특성을 지니고 있다. E. coli(4-9), Vibrio succinogenes, Desulfovibrio multispirans로부터 분리한 FRD는 막에 결합되어 있으며, fumarate에서 succinate로의 최종전자전달 반응을 촉매화하는 반면, 맥주효모나 빵효모, Methanobacterium thermoautotrophicum의 FRD는 세포질 상에 존재하는 용해성 효소이며 생합성적 기능을 갖는다(10). 전자의 정제된 FRD는 공유적 또는 비공유적으로 결합된 flavin adenine dinucleotide(FAD)를 함유하고 있으며, 후자의 M. thermoautotrophicum은 빵효모나 맥주효모와는 다르게  보조인자로서 flavin을 함유하고 있지 않다. 막에 부착된 FRD는 두 개의 촉매영역과 두 개의 anchor영역으로 나뉠 수 있는데, 촉매영역에서는 66와 27kDa(dalton)의 단량체와 anchor영역에서는 15, 13kDa의 단량체로 구성되어있다(8). 66kDa인 FRD-A는 FAD를 함유하고 있으며, 27kDa인 FRD-B는 iron-sulfur cluster를 함유하는 것으로 알려져 있다.

본 실험실에서 새로이 분리한 Enterococcus sp. RKY1은 통성혐기성인 그람양성박테리아로서 숙신산을 보다 높은 수율로 생산할 수 있다. 본 균주의 fumarate환원에 의한 숙신산 생산에 기여하는 막에 부착된 것으로 추정되는 FRD의 모형을 제안하였다(Fig 1.).

실험

효소생산 및 분리조건

Enterococcus sp. RKY1 KCTC 8890P를 혐기적으로 배양하여 세포를 얻었다(20g/l, wet cell weight). 배양액을 15,000×g에서 15분간 원심분리하여 세포를 수집한 후, 0.1M sodium phosphate buffer(pH=6.8)에 두 번 정도 세척 및 현탁을 행하였다. 이 후 모든 과정에서 동일한 완충액을 사용하였다. 이 현탁액을 4℃에서 sonicator로 파쇄하여, 조효소액을 얻었다. 이를 15,000×g 15분간 원심분리하여 세포파쇄물과 상등액의 활성을 측정하여 FRD의 위치를 확인하였다. 파쇄물을 비이온성 계면활성제인 Triton X-100(0.1%, v/v)으로 4℃에서 1시간 동안 교반한 후, 26,000×g, 30분간 원심분리하여 상등액을 얻었다. 계면활성제를 제거하기 위해 NH4OAc(17.5%, v/v)를 첨가하여 45분간 교반하였다. 이를 다시 16,000×g, 10분간 원심분리하여 상등액을 Beckman 70Ti rotor를 사용하여 150,000×g, 1시간 동안 초원심분리를 행하여 모아진 침전물을 완충액에 현탁하여 사용할 때까지 -20℃에 보관하였다. 모든 절차는 활성측정시 환원제를 첨가한 것을 제외하고는 특별한 혐기적 조건없이 수행되었다.

효소활성측정

효소활성은 Lemire 등(5)의 방법을 조금 변경하여 측정하였으며, 효소활성의 1 Units은 분당 환원된 benzyl viologen의 1□mol에 해당하며, 550nm에서 benzyl viologen의 몰흡광계수는 7.8×103M-1cm-1이라한다. 모든 결과는 세 번이상 반복실험하여 평균값을 취했다.

단백질 농도 결정

정제의 각 단계에서 Bradford 법(11)을 이용하여 결정하였다. 표준단백질로서는 1mg/ml의 bovine serum albumin을 사용하였다.

효소의 최적 pH 및 온도결정

조효소액의 각 온도와 pH에 대해 최적온도와 최적 pH를 결정하였다.

결과 및 고찰

조효소액을 원심분리하여 얻은 상등액과 침전물의 활성을 측정하여 FRD 활성이 막에 현저하게 나타남을 밝혔다(Table 1). 따라서 FRD가 막에 부착된 단백질임을 확인하였으며, 비이온성 계면활성제인 Triton X-100으로 처리한 후, 막에 부착된 단백질들을 분리하였다(12, 13). FRD에 특이적인 정제절차는 현재 수행중에 있다. 혐기적 세포배양 후, 호기적으로 처리하여 분리하였으나 검출될 만한 활성손실은 관찰되지 않았다. FRD의 전자공여체로서 benzyl viologen을 사용하였으며, sodium dithionite 용액의 산소에 대한 불안정성은 2-mercaptoethanol로 보완하였다. 조효소액에서의 FRD 양에 따른 활성의 선형도를 Fig. 2에 보였다. 실온에서 방치한 시간에 따라 효소활성의 50%이상을 손실하였고 자료는 보이지 않았지만 24시간 이후에는 활성의 대부분을 잃었다(Fig. 3). Lineweaver-Burk

Table 1.

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Total       Total       Specific

Separation            protein     activity      activity

step               (mg)     (Units;U)      (U/mg)

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crude extract        184.44      7478.5        40.55

Ultrasonication

Supernatent         24.76        24.20       0.98

Pellet              158.97       166.76       1.05

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plot을 하였을 때 FRD의 fumarate에 대한 겉보기 Km값은 0.81mM을 나타내었다(Fig. 4). FRD의 최적 pH는 6.8이었고(Fig. 5), 6.0와 7.2에서 80% 이상의 활성을 유지시킬 수 있었다. 최대 활성을 나타내는 최적온도는 35℃이었다(Fig. 6). 35℃와 40℃에서 활성의 90% 이상을 유지시킬 수 있었다. 본 균주의 FRD는 혐기적으로 발현되나, 호기적 상태에서도 특별한 영향을 받지 않았으며, 산소에 저항성이 있음을 알 수 있었다.

참고문헌

1. Van Hellemond, J. J. and A. G. M. Tielens, "Expression and Functional

Properties of Fumarate Reductase.", Biochem. J., 304, 183(1994).

2. Datta, R., "Process for the Production of Succinate Acid by Anaerobic Fe-    rmentation", U. S. Patent, 5,143,833(1992).

3. Glassner, D. A., "Process for the Production and Purification of Succinic

Acid.", U. S. Patent, 5,143,184(1993).

4. Margaret, E. S. and J. R. Guest, "Isolation and Properties of Fumarate

Reductase Mutant of E. coli.", J. Bacteriol., 114(2), 563(1973).

5. Lemire, B. D. and J. H. Weiner, "Fumarate Reductase of E. coli.", Meth.

in Enzymol., 126(36), 377(1986).

6. Lemire, B. D., J. J. Robinson, R. D. Bradley, D. G. Scraba, and J. H. Wein-    er, "Structure of Fumarate Reductase on the Cytoplasmic Membrane of E.

coli.", J. Bacteriol., 155(1), 391(1983).

7. Weiner, J. H. and P. Dickie, "Fumarate Reductase of E. coli.", J. Biol.

Chem., 254(17), 8590(1979).

8. Lemire, B. D., J. J. Robinson, and J. H. Weiner, "Identification of Membr-    ane Anchor Polypeptides of E. coli Fumarate Reductase.", J. Bacteriol., 152    (3), 1126(1982).

9. Robinson, J. J. and J. H. Weiner, "Molecular Properties of Fumarate Red-    uctase Isolated from the Cytoplasmic Membrane.", Can. J. Biochem., 60, 811

(1982).

10. Khandekar, S. S. and L. D. Eirich, "Purification and Characterization of

an Anabolic Fumarate Reductase from Methanobacterium thermoautotrophi-    cum.", Appl. Environ. Microbiol., 55(4), 856(1989).

11. Bradford, M. M., "A Rapid and Sensitive Method for the Quantitation of

Microgram Quantities of Protein Utilizing the Principle of Protein-Dye Bin-    ding.", Anal. Biochem., 72, 248(1976).

12. Hederstedt, L., E. Holmgren, and L. Rutberg, "Characterization of a Suc-    cinate Dehydrogenase Complex Solubilized from the Cytoplasmic Membrane

of B. subtilis with the Non-ionic Detergent Triton X-100.", J. Bacterol.,

138(2), 370(1979).

13. Dickie, P. and J. H. Weiner, "Purification and Characterization of Membr-    ane bound Fuamrate Reductase from Anaerobically Grown E. coli.", Can. J.

Biochem., 57, 813(1979).