2단계 회분식 발효에 의해 생산된 세포외다당류의 배양학적 및

물리화학적 특성

박 상 준, 조 대 행, 김 의 용

서울시립대학교 화학공학과

The cultural and physicochemical properties of exopolysaccharide produced by Two-stage batch fermentation

Sang Jun Park, Dae Haeng Cho, Eui Yong Kim

Dept. of Chemical Engineering, The University of Seoul

서    론

세포외다당류를 생산하는 미생물의 회분식 배양에서 최적의 균체 증식조건과 최대의 다당류 생산조건이 서로 다른 경우, 단일 회분식 발효(Single-stage batch fermentation)를 통해선 이 서로 다른 조건들을 동시에 만족시킬 수 없다[1]. 그러나 2단계 회분식 발효(Two-stage batch fermentation)는 배양 초기에 최적의 균체 증식 조건으로 고농도 균체 배양을 한 후, 최대의 다당류 생산 조건으로 배양액을 조정함으로써 단일 회분식 발효에서보다 다당류 생산량을 증가시킬 수 있다[2]. 또한 단일 회분식 발효의 균체 증식 단계에서 배양액의 점도는 다당류 생산량에 비례하여 증가하지만 비증식 단계에선 감소현상을 보이는 경우가 있는데 이는 생산된 다당류가 산성화된 배양액에 의해 부분적으로 산 가수분해되거나 세포외효소(exoenzyme)에 의해 구조적인 변화를 일으킨 것으로 분자량의 감소를 의미한다[3].

한편 용도면에서 미생물성 다당류는 분자량, 구성당의 종류, 결합양식 등에 따라 다양한 물성 및 기능성을 가지므로 각종 산업분야에서 사용되고 있다. 특히 식품산업에서는 유화제, 안정화제, gel 형성제로, 화장품산업에서는 보습제로, 환경정화를 위한 폐수처리 공정에서는 중금속 흡착제, 응집제 등으로 사용되고 있다.

본 연구에서는 단일 회분식 발효에서 배양액의 점도와 다당류 분자량과의 관계를 조사하고, 2단계 회분식 발효의 배양학적 특성과 이를 통해 생산된 다당류의 물리화학적 성질을 조사함으로써, 새로운 용도로의 개발을 모색하고자 한다.

재료 및 방법

사용균주 : Rhodotorula glutinis K-501은 낙엽수에서 분리하여 한국생명과학 연구소에서 동정되었다.

Experiments	C/N conc.
	1st stage	2st stage
Control	30/2	-
Exp. 1	15/1	15/1
Exp. 2	15/1	15/0
Exp. 3	15/2	15/0

배지

Experiments	Initial pH
	1st stage	2st stage
Control	4	-
Exp. 1	7	4

및 배양조건 : 단일 회분식 발효공정(Control)의 배지로는 glucose 30 g/l, (NH4)2SO4, 2  g/l, KH2PO4 1 g/l, MgSO4 0.5 g/l, CaCl2 0.1 g/l, NaCl 0.1 g/l를 기본배지로 하여 22℃, pH 4에서 7일간 배양하였다. 2단계 회분식 발효공정의 배지조성과 배양기간은 단일 회분식 발효공정과 같으며, 각 단계에서  변화시킨  매개변수들 (C/Nratio,  pH)의  조건은  다음과  같다.

* pH 조정 : 2 M NaOH solution.

분자량의 측정 : 각 단계에서 회수한 시료를 정제하여 HPLC(HP 1100 series)와 RI detector(HP 1047A)를 이용하여 TSK-GEL column(G5000PWXL, TOSOH Co., Tapan)으로 gel permeation chromatography법에 의해 분자량을 측정하였다. 표준물질로는 분자량 75만, 41만, 15만, 5만 dalton인 dextran(Fluka Chem. Co., Swiss)을 사용하였다. 용매는 0.1 M NaNO3, 주입 부피는 50□l, 유속은 0.8 ml/min, 온도는 30℃로 실시하였다.

표면장력과 계면장력의 측정 : 다당류의 물에 대한 표면장력과 Oil/Water(hexadecane 0.1ml, water 10ml)에 대한 계면장력은 각 농도별로 시료 수용액을  만들어  20℃에서  Wilhelmy-type  automated surface tensiometer (CBVP-A3, Kyowa Interface Science Co., Ltd., Tokyo)를 이용하여 측정하였다.

점도 측정 : 배양액의 점도는 Brookfield viscometer(Model LVDV-Ⅱ+)와  small sample adapter를 이용하여 25℃, 7.92 S-1(shear rate)에서 측정하였다.

결과 및 토론

단일 회분식 발효에서 시간에 따른 배양액의 점도와 생성 다당류의 분자량변화를 Table 1에 나타내었다. 배양액의 점도는 균체 증식의 정지기(96hr)까지 증가(최대 점도: 65cP)하다가, 다당류 생성량이 계속 증가함에도 불구하고 점차 감소하여 사멸기(168hr)에서는 31cP이였다. 분자량은 균체 증식의 정지기에서 37만, 사멸기의 중간단계(112hr)에서는 20만, 최종단계(168hr)에서는 약 10만 정도로 감소하였다. Fig. 1은 C/N ratio에 의한 2단계 회분식 발효를 나타낸 것으로 초기 C/N ratio를 7.5로 하여 배양을 시작한 후, 균체 증식의 정지기때 탄소원만 15g/l 첨가하여 C/N ratio를 15로 높인 것(Exp 3)이 다른 대조구들보다 균체량에서 3.54 ∼ 33.2%의 증가를 보였고, 다당류 생성량도 17.7 ∼ 93.0% 증가하였다. 그러나 사멸기에서 배양액의 점도감소 현상은 여전히 나타났다. 이는 앞선 실험을 통해 균체 증식에는 낮은 C/N ratio(4.3-10), 다당류 생산에는 이 보다 높은 C/N ratio(15)가 최적인 조건이였다는 결과와 잘 일치하였다. 또한 초기 pH에 대한 영향에서 균체 증식에는 pH 7.0, 다당류 생산에는 pH 4.0이 최적인 조건임이 앞선 실험을 통해 밝혀졌었다. 이에 따른 2단계 회분식 발효의 실시 결과를 Fig. 2에 나타내었다. 초기 pH를 7.0으로 하여 배양을 시작한 후, 균체 증식의 정지기때 배양액의 pH를 4.0으로 조정한 결과, 생성 다당류량은 단일 회분식 발효와 비교하여 큰 차이가 없었으나 사멸기에서 배양액의 점도감소 현상은 일어나지 않았으며(118cP) 분자량은 67만으로 측정됐다. 이 결과를 통해 단일 회분식 발효의 사멸기에서 분자량 감소는 산성화된 배양액(최종 pH : 1.82)에 의해 다당류가 부분적으로 산 가수분해를 일으켰기 때문임을 알 수 있었다.

Rhodotorula glutinis K-501에 의해 생산된 다당류의 물에 대한 표면장력과 Oil/Water에 대한 계면장력은 Fig. 3에 나타내었다. 다당류의 농도별로 물에 대한 표면장력을 측정한 결과 농도가 75mg/l까지 증가함에 따라 표면장력이 급속히 감소하였으며 그 이상의 농도에서는 일정한 값의 표면장력을 나타내었다. 따라서 임계미셀농도는 75mg/l이었으며 표면장력은 46.3dyne/cm의 값을 가졌다. Oil/Water에 대한 계면장력은 물과 Hexadecane만이 혼합되어있을 경우 68.3dyne/cm이었으나, 첨가된 다당류량이 증가할수록 낮아지다가 다당류의 농도가 80mg/l 이상에서는 약 41.2dyne/cm로 일정하게 유지되었다. 이는 다당류가 서로 섞이지 않는 두 액체의 계면에 흡착하여 계면의 성질을 변화시킨 것으로 생체계면활성제로써 사용가능성을 의미한다.

Elapsed fermentation time (hr)	Dry cell weight (g/l)	EPS conc. (g/l)	Apparent viscosity (cP)	Molecular weight(dalton)
96	6.98	2.74	65	370,000
112	6.74	3.25	44.5	200,000
168	6.01	4.23	31	100,000

Table 1. Variation of viscosity and molecular weight during the single-stage batch fermentation.

참 고 문 헌

1. Lo, Y. M., Yang, S. T., Min, D. B., Appl. Microbiol. Biotechnol., 47, 689-694 (1997)

2. Maria, L. K., Emanuel, S. T., Chem. Eng. Technol., 20, 354-360 (1997)

3. Elizabeth, A. B., Robert, D. S., Appl. Environ. Microbiol.  Sept, 629-633 (1985)