유기산 혼합물 및 돈사폐수를 이용한 생분해성 고분자 (PHBV)의 생산

유형덕, 윤지용, 김태용, 박창호

경희대학교 화학공학과, 환경연구소

Production of Biodegradable Plastics (PHBV)

from Organic Acid Mixtures and Swine Waste

Hyung-Duk Yoo, Ji-Yong Yoon, Tae-Yong Kim, Chang-Ho Park

Department of Chemical Engineering and Institute of Environmental Science,

Kyung Hee University, Yongin-Si 449-701, Korea

서론

고분자 제품은 현재 전 세계적으로 인류의 생활에 유용하게 사용되고 있으나 분해성이 거의 없어 사용 후 폐기하였을 때 환경오염을 유발한다. 이 문제를 해결하기 위해서 polyhydroxyalkanoates (PHA), polysaccharides, polylactide 등의 생분해성 고분자에 관한 연구가 수행되어왔다.

본 연구는 돼지분뇨속에 함유된 다량의 유기산을 이용하여 PHA의 일종인 PHBV (polyhydroxybutyrate-valerate)의 생합성 가능성을 모색하기 위해 돼지분뇨와 유사한 농도로 이루어진 유기산 혼합액 및 실제 돼지분뇨를 이용한 고분자 생산 가능성에 대한 실험을 수행하였다.

재료 및 실험방법

1. 균  주

비탄소성분(질소, 인 등)의 제한상태가 아니라도 PHBV를 생산하는 새로운 균주인 Azotobacter vinelandii UWD (ATCC 53799)를 이용하여, Burk 배지에 적응 배양시킨 후 agar plate로 옮겼다. 균주는 30℃ 조건에서 배양시켰다.

2. 생장 배지

A. vinelandii UWD는 여러 가지 탄소와 질소원을 함유한 변형된 Burk 배지에서 생장시켰다. 변형된 Burk 배지는 1.47 mM KH2PO4, 4.60 mM K2HPO4, 0.81 mM MgSO4, 0.58 mM CaSO4, 18.0□M FeSO4, 1.0□M Na2MoO4 그리고 42.0□M FeC6H5O7을 포함하고 있다. pH는 7.3으로 조절하였다.

3. 배양 방법

유기산을 이용한 A. vinelandii UWD의 플라스크 진탕 배양 실험은 15 mM NH4Cl 과 서로 다른 유기산(acetic acid, propionic acid, butyric acid)으로 구성된 Burk 배지에서 30℃, 250rpm에서 배양되었으며, 발효기 실험에서는 7L Fermentor를 사용하였고, 온도는 30℃ pH는 7.3으로 유지하였다.

4. PHBV 및 유기산 농도분석

PHBV는 acid propanolysis 법(1)으로 분석했다. PHBV에서 분해된 단량체는 GC(HP 5890)에 의해 분석했고, benzoic acid (Sigma)를 internal standard로 이용하였다.  유기산 농도의 분석은 sample 0.5 mL에 0.5 N HCl 0.5 mL를 첨가한후 PHBV 분석과 동일한 조건에서 동일한 GC (HP  5890)를 사용하였다.

결과

1. 각 유기산 및 유기산 혼합액을 이용한 A. vinelandii UWD 균주의 생장

돼지분뇨 원액내에 들어있는 주요 탄소원은 분석결과 acetic acid, propionic acid 및 butyric acid 이고 평균 농도는 각각 7.2 g/L, 2.2 g/L 및 2.7 g/L 이었으며 충분한 양의 질소원과 무기질원을 함유하고 있었다. 개별 유기산을 이용한 shake flask 실험에서 A. vinelandii UWD 균주 생장에 필요한 최적의 유기산 농도는 acetic acid 1.0∼3.5 g/L, propionic acid 0.7∼2.0 g/L, butyric acid 0.5∼2.0 g/L 이었다(Figure 1).  Table 1에 기술된 바와 같은 농도의 돼지분뇨의 원액 또는 희석액을 모사한 유기산 혼합물을 기질로하여 A. vinelandii UWD 균주를 배양하였을때 돼지분뇨 희석 비율에 따른 비생장속도와 최대 O.D.의 변화를 Figure 2에 나타내었다. 두 배로 희석된 돼지분뇨에 해당하는 유기산 혼합액이 세포생장에 최적 농도임을 알 수 있었다.

2. 돼지분뇨를 이용한 A. vinelandii UWD 생장과 고분자 생산

두 배로 희석한 돼지분뇨만을 탄소원으로 이용하는 배양을 발효기에서 수행하였을때 A. vinelandii UWD는 acetic acid를 우선 사용하여 농도가 2.4 g/L되었을 때 propionic acid사용 되었고 그런다음 butyric acid가 소모되었다(Figure 5a).  균주 생장을 Figure 3b에 나타내었는데 접종후 18시간이 지나 본격적으로 생장을 시작하였다. 돼지분뇨로부터 생산된 고분자는 HB와 HV로 구성되고 HV의 함량은 매우 낮았다. Acetic acid만이 이용되는 기간에는 고분자가 거의 축적되지 않았다(Figure 3c). 세포건조질량중의 고분자 함량 (PHBV wt%)은 propionic acid와 butyric acid가 소모되면서 증가되기 시작하였다. 그러나 최종 PHBV 양(wt%)은 약 5 % 에 불과하였으며, 생산수율은 0.010 (g□PHBV)/(g□총유기산), 최종 고분자농도는 0.06 g/L이었다.

3. 돼지분뇨와 포도당이 혼합된 배지에서의 기질의 이용과 세포 생장

두배로 희석한 돼지분뇨만을 탄소원으로 이용했을 때 탄소원의 한정으로 세포생장 및 고분자 생산이 잘 이루어지지 않았으므로 다른 탄소원인 포도당(30 g/L)을 두배로 희석한 돼지분뇨에 첨가한 실험에서 A. vinelandii UWD는 diauxic 생장형태가 관찰되었다(Figure 4a). 두배로 희석한 돼지분뇨에는 acetic acid, propionic acid, butyric acid가 각각 3.50 g/L, 1.14 g/L, 1.36 g/L 함유되었으며 valeric acid도 0.36 g/L 검출되었다. 유기산은 acetic acid, Propionic acid, butyric acid 그리고 valeric acid 순으로 사용되었고,  30시간 정도 경과되었을 때 모두 고갈되었다. 그리고 4시간의 지연기후 포도당이 감소하기 시작하였다. 포도당 이용단계에서 acetic acid와 butyric acid가 소량 생산되어 pH가 낮아졌으며 포도당은 53시간 경과 후 완전히 소모되었다. Figure 4b는 Figure 4a에서의 기질이용 패턴에 대응하는 A. vinelandii UWD 세포량 변화를 보여준다. 산(acid) 소모 단계에서 비생장속도는 약 0.073 hr-1로 일정하였다.  포도당 소모단계에서는 비생장속도가 0.090 hr-1가 되었다. 유기산 소모단계에서 세포량(RM) 수율은 0.167 g/(g·유기산)이었고, 포도당 소모단계에서의 세포량 수율은 0.117 g/(g·포도당)이었다. 최종 건조 세포량은 9.36 g/L 였다.

4. 돼지분뇨와 포도당이 혼합된 배지에서의 고분자 생산

Acetic acid 소모 단계동안 PHBV는 거의 생성되지 않았다. Propionic acid, butyric acid, valeric acid가 소모됨에 따라 PHBV 양은 18.3 wt% 까지 증가하였다(Figure 4c).  포도당 대사가 시작된 이후 PHBV의 양은 급격히 증가하였고, 최대값인 55.6 wt%에 이르렀으며, 최종 PHBV 농도는 5.16 g/L였다. 포도당 소모단계에서의 총생산 수율은 0.2 (g□PHBV)/(g□포도당)로 줄어드는 것을 알수 있었다. Copolymer를 형성을 위한 HV 생산은 유기산 소모단계에선 최대값 10.0 mol%에 이르렀다. 포도당 소모단계에선 HB의 증가로 인해 HV 양(mol%)은 계속 감소하였으나(Figure 4d) 총 HV 양은 0.045 g/L에서 유지되었다. HV 생산은 돼지 분뇨내의 valeric acid 및 propionic acid 로부터 주로 생성되었다. 두 배로 희석된 돼지분뇨에 포도당 30 g/L이 첨가됨으로써 최종 총 세포량은 두 배로 희석한 돼지분뇨만을 사용할 때 보다 8배가 더 높은 9.36 g/L로 증가 되었고  최종 PHBV 농도도 5.16 g/L으로 86배가 더 높았다. 이러한 결과는 돼지분뇨로부터 PHBV를 생산할 때 탄소원이 풍부한 다른 폐기물원료를 동시에 사용하면 미생물 및 고분자 생산에 적절히 균형잡힌 배지가 되어 생산량을 증대시킬 수 있다는 것을 의미한다.

참고문헌

1. Riss, V. and W. Mai (1988), Gas Chromatographic Determination of poly-□-hydroxy-    butyric Acid in Microbial Biomass after Hydrochloric Acid Propanolysis, J. Chrom.,     445, 285∼289.

2. Page, W. J., (1992), Production of Polyhydroxyalkanoates by Azotobacter vinelandii     UWD in Beet Molasses Culture, FEMS Microbiol. Rev., 103, 149∼158.

3. Page, W. J. and O. Knosp (1989), Hyperproduction of poly-□-hydroxybutyrate during

Exponential Growth of Azotobacter vinelandii, Appl. Environ. Microbiol., 55, 1334∼    1339.

Table 1. Concentration of individual acids in organic acid mixture simulating  swine waste

Concentration relative to swine waste	Dilution ratio	Acetic acid (g/L)	Propionic acid (g/L)	Butyric acid (g/L)
0.25	4	1.88	0.50	0.50
0.50	2	3.75	1.00	1.00
0.67	1.5	5.00	1.33	1.33
0.83	1.2	6.25	1.67	1.67
1.00	1(undiluted)	7.50	2.00	2.00
1.10	-	8.25	2.20	2.20

Figure 2. Specific growth rate and maximum optical density of A. vinelandii UWD grown on acid mixtures simulating different concentrations of swine waste.

Figure 1. Specific growth rate of A. vinelandii UWD on acetic acid propionic acid and butyric acid.

Figure 3. Growth and polymer production of A. vinelandii UWD in two times diluted swine waste : (a) carbon substrates utilization; (b) biomass production; (c) polymer production; (d) HV production.

Figure 4. Substrates utilization, cell growth and polymer production of A. vinelandii UWD in the mixture of two times diluted swine waste and 30 g/L of glucose: (a) carbon substrates utilization; (b) cell growth; (c) PHBV production; (d) HV content (mole%).