유기산 및 포도당 혼합배지에서 Azotobacter vinelandii UWD의

생장 및 PHBV 생산에 대한 질소원의 영향

박찬엘, 김태용, 박창호

경희대학교 화학공학과, 환경연구소

Effect of Nitrogen Source on the Growth of Azotobacter vinelandii UWD and Production of PHBV in the Mixture of Organic Acids and Glucose

Chan-El Park, Tae-Yong Kim, Chang-Ho Park

Department of Chemical Engineering and Institute of Environmental Science,

Kyung Hee University, Yongin-Si, 449-701, Korea

서론

사용 후 폐기되는 플라스틱으로 인한 환경오염을 방지하는 대체물질로서 polyhydroxyalkanoates (PHA)가 유용할 것이라는 판단하에 미생물에 의한 PHA 생산이 꾸준히 연구되어 왔고 탄소원으로는 포도당등이 주로 사용되고 균주로는 Alcaligenes eutrophus 등이 주로 연구되었다 (1).  본연구는 돼지분뇨내의 유기물을 처리함과 동시에 PHB(V)를 생산하는 기술에 관한 연구의 일환이다(2). PHA의 일종인 PHB(V)를 생산하는 대부분의 미생물은 영양소 제한을 필요로 하며 그 중 질소를 제한하는 방법이 가장 흔히 사용되었다(3).

본 연구는 질소를 고정해야 하는 배양조건이 배지내에 질소원이 공급되는 조건보다 PHBV 생산에 유리한가 아닌가에 대한 문헌상의 불명확성을 확인하기 위하여 배지내의 초기암모늄 농도가 UWD균주의 생장 및 PHBV 생산에 미치는 영향을 연구하였다.

재료 및 실험방법

1. 균주

동결 건조된 Azotobacter vinelandii UWD (ATCC 53799)를 American Type Culture Collection으로부터 구해서 Burk 배지에 적응 배양시킨 후 agar plate로 옮겼다. 균주는 30℃ 조건에서 배양시키고 일주일에 한 번씩 계대하였다.

2. 생장 배지

제한 배지를 사용하여 A. vinelandii UWD를 탄소원으로 acetic acid 3.75 g/L, propionic acid 1.10 g/L, butyric acid 1.30 g/L 및 포도당 30 g/L를 함유한 변형된 Burk 배지에서 생장시켰다. 변형된 Burk 배지는 1.47 mM KH2PO4, 4.60 mM K2HPO4, 0.81 mM MgSO4, 0.58 mM CaSO4, 18.0 □M FeSO4, 1.0 □M Na2MoO4 그리고 42.0□M FeC6H5O7을 포함하고 있다. pH는 고압 멸균한 후에 7.3으로 조절하였다. 초기 암모늄의 농도가 12mM 과 48mM인 두종류의 배지가 사용되었다.

3. 7 L 발효기 System

날개를 네개 가진 3개의 터빈과 3개의 baffle을 갖춘 7 L top drive 발효기 (한국발효기)가 이 연구에 사용되었다. 발효기 공정은 486 microcomputer에 Labtech Notebook software를 이용하여 조절되고 수집되었다(Fig. 1).

4. 시료 및 포도당 농도 분석

발효 공정동안 세포생장, 기질소비, 생성물을 분석하기 위해 1-2 시간 간격으로 시료를 채취하였다. 7 L 발효조로부터 10 mL씩 두 개의 시료를 시료구를 통해 취하여 즉시 원심 분리하였고 620nm에서 optical density(O.D.)를 측정하였다.  포도당 농도는 고정화 효소막(YSI 2365 glucose(dextrose) membrane)이 설치된 포도당 분석기(Yellow Spring Instrument Co.)로 측정하였다.

5. PHBV 및 유기산 농도 분석

PHBV는 acid propanolysis 법(4)으로 분석했다. 이 방법은 propanol과 염산을 이용한 가수분해와 transesterification에 근거하고 있다. PHBV는 단량체로 분해되고 propyl ester로 전환되어 GC (HP 5890)에 의해 분석된다. 유기산 농도의 분석은 sample 0.5 mL에 0.5 N HCl 0.5 mL를 첨가한후 PHBV 분석과 동일한 조건에서 동일한 GC (HP 5890)를 사용하였다.

6. 암모늄 분석

Sample 상등액내의 암모늄 농도는 암모니아 전극(Orion Research Inc.)을 pH meter(Orion Research Inc.)에 연결하여 mV 로 측정하였다. 표준곡선은 선형축에 mV 값을 기록하고 표준 농도값을 log 축에 기록한 semi log chart에 작성되었다. 발효 sample의 암모늄 농도를 이 표준곡선으로부터 결정하였다.

결과

질소를 고정하는 경우와 고정하지않는 경우의 Azotobacter vinelandii UWD 세포의 생장과 PHBV 생산을 비교하였다. 배지내의 초기 암모늄의 농도를 12mM (실험 1)과 48mM (실험 2)로 두 번씩 반복 실험하였다. 실험 1과 실험 2의 경우 모두 세포는 유기산을 우선 소모하여 생장하고 (acid phase) 그후 포도당을 소모하는 (glucose phase) diauxic 생장 형태를 보였다 (Fig. 1 and 2).  실험 1에서는 배양을 시작할 때 배지내에 공급된 ammonium (12mM)은 acid phase가 끝날 무렵인 17-18 시간후에 소진되고 그 이후 배양액 내에는 ammonium이 거의 검출되지 않았으나 세포생장이 지속되는 것으로 보아 세포가 질소를 고정하고 있는 것으로 판단된다 (Fig. 1). 실험 2에서 발효 종료 후 잔류 ammonium의 농도가 약 8mM인 것으로 보아 실험기간 내내 ammonium이 제한되지 않고 질소고정이 일어나지 않았음을 의미한다 (Fig. 2). 실험 1 과 2에서 acid phase 기간에 소모된 ammonium의 양은 약 11mM로 거의 동일하였고 실험 2에서 glucose phase 기간에 약 30mM의 ammonium이 소모되었다. Acid phase에서의 비생장속도는 실험 1에서 0.166hr-1, 실험 2에서 0.165hr-1 으로 세포생장은 두 실험에서 거의 유사하였다 (Fig. 1 and 2, Table 1). 실험 1의 biomass 수율과 (0.135g/g acid) 실험 2의 수율도 (0.142g/g acid) 거의 유사하였다. 이상의 결과는 실험에 사용한 초기 ammonium 농도가 (12mM ∼ 48mM) UWD 균주의 생장을 저해할 정도로 지나치게 낮거나 높지 않음을 의미한다. 반면 acid phase에서 PHBV 생산은 초기 ammonium의 양이 적을 때 (실험 1) 저조하였다.  실험 1의 acid phase 말기에 PHBV 생산은 23.5 wt%로서 실험 2의 33.4 wt% 보다 낮았다. PHBV 수율도 실험 1 (0.051g PHBV/g acids)이 실험 2 (0.078 PHBV/g acids)보다 35% 낮게 나타났고 PHBV 생산속도도 실험 1 (0.035g PHBV/g RM-hr)이 실험 2 (0.057g PHBV/g RM-hr)보다 39% 낮게 나타났다. Glucose 소모기에는 초기 ammonium의 양의 차이로 인한 세포생장과 PHBV 생산의 차이가 두드러졌다 (Fig. 1 and 2, Table 1). 질소제한 조건하 (실험 1)에서 포도당 소비속도는 0.992g/L-hr로 실험 2에서의 소비속도(0.791 g/L-hr)보다 25% 빨랐다.(5). 실험 1의 포도당 비소비속도 (specific glucose consumption rate)는 0.569 g/g RM-hr로 실험 2의 0.396 g/g RM-hr보다 44% 높았다. 그러나 biomass 수율은 실험 1 (0.059g/g 포도당)이 실험 2 (0.076 g/g 포도당)보다 22% 낮았다.

참고문헌

1.  Doi, Y. (1990), Microbial Polyesters, VCH Publishers, New York.

2. Cho, K.-S., H.W. Ryu, C.-H. Park, and P.R. Goodrich (1997), Poly(hydroxybutyrate-co-hydroxyvalerate) from swine waste liquor by Azotobacter vinelandii UWD, Biotech. Lett., 19, 7-10.

3. Steinbiichel, A. and H. G. Schlegel (1991), Physiology and Molecular Geneties of poly(3-hydroxyalkoanoic acid) Synthesis in Alcalignenes eutrophus, Molecular Microbiology, 5, 535-542.

4.  Riis, V., and W. Mai (1988), Gas Chromatographic Determination of poly-3-hydroxybutyric Acid in Microbial Biomass after Hydrochloric Acid Propanolysis, J. Chromatogr., 445, 285-289.

5.  Page, W. J., and O. Knosp (1989), Hyperproduction of poly-□-hydroxybutyrate during Exponential Growth of Azotobacter vinelandii UWD, Applied and Environmental Microbiology, 55, 1334-1339.

Table 1. Effect of ammonium supply on the growth and polymer production

of A. vinelandii UWD.

		Run 1	Run 2
Initial ammonium concentration (mM)		11.84	48.18
Ammonium consumption (mM)	Acid phase	11.68	10.72
	Glucose phase	N2 fixation	29.75
	Overall	11.84	40.47
Biomass yield (g RM/g C sources)	Acid phase	0.135	0.142
	Glucose phase	0.059	0.076
PHBV yield (g/g C source)	Acid phase	0.051	0.078
	Glucose phase	0.158	0.203
Average PHBV production rate (g PHBV/g RM-hr)	Acid phase	0.035	0.057
	Glucose phase	0.073	0.080

Fig. 1. PHBV production by A. vinelandii            Fig. 2. PHBV production by A. vinelandii

UWD under nitrogen limitation (run 1).              UWD under nitrogen limition (run 2).