Polychlorinated Biphenyls(PCBs)의 생물학적 처리;

- 미생물의 분리, 특성 및 고정화 -

정선용

전남대학교, 환경공학과

Biological Treatment of Polychlorinated Biphenyls(PCBs);

- Isolation, Characterization, and Immobilization of Microorganism -

SEON YONG CHUNG

Chonnam National University, Dept. of Environmental Engineering

서론

Polychlorinated biphenyls(PCBs)는 벤젠고리 두 개가 결합되어 형성된 biphenyl에 염소가 1-10개 치환가능하여 이론적으로 총 209가지의 이성체를 가질수 있는 복잡한 화합물이다. PCBs의 가장 두드러진 특징은 안정성과 화학적 불활성이다. 또한, 낮은 유전상수 (dielectic constants)와 높은 열용량 (heat capacity)은 PCBs의 사용이 전기용량기 (electrical capacitors)와 변압기 (transformers)에서 가장 이상적인 물질이 되게 하였다. PCBs는 전기전도성, 열안정성, 절연성 측면에서 물리·화학적으로 안정된 화합물이기 때문에 한번 사용하면 몇 십년을 사용할 수 있다.  이러한 이유 때문에 1970년대까지 지구상에서 가장 많이 사용된 □악마의 거북등□ 이라는 별명을 가진 인공화합물 중의 하나이다.  인간이 PCBs에 중독된 사건은 일본에서 최초로 발생하였고, 1960년도 후반부터 생체실험을 통하여 PCBs가 새로운 유전독물이라는 사실이 인정이 된 후, 1970년대의 중반부터 PCBs의 사용과 생산이 중지 되었다. 그러나 사용과 생산이 중지될 당시, 이미 세계적으로 수십만톤의 PCBs가 자연 환경으로 방출되었고, 폐기처분할 양만 해도 사용한 양의 거의 두배가량이 남아 있었다.

PCBs의 처리방법은 물리·화학적 방법과 생물학적 방법으로 구분할 수 있다. 그러나 물리·화학적 방법의 적용은 PCBs 보다 독성이 훨씬 강한 제 2의 오염물질이 생성될 우려가 있기 때문에 실용화가 어려운 실정이다. 무공해 처리방법인 미생물에 의한 PCBs 처리법은 80년대 이전에는 사실상 불가능하였다. 이러한 이유는 80년대 이전의 미생물 배양기술로는 PCBs 자체의 독성과 대사산물에 의한 Feed Back 현상으로 일어나는 효소 생성 능력 저하를 막을 수 없었기 때문이었다. 그러나 80년대 이후에 미생물 육종학, 단백질공학, 유전공학 및 분자생물학의 발달로 PCBs의 미생물학적 처리가 재검토되기 시작하였고, 현재 세계적으로 연구가 활발히 진행되고 있다. 이러한 연구의 결과 PCBs의 미생물에 의한 분해 메카니즘에 대하여 거의 밝혀 졌고, 또한 관련효소 및 유전자에 관해서도 많은 정보가 모아졌다1). 그러나 실제로 이러한 기술을 이용한 PCBs의 처리에 관해선 아직 까지 이렇다 할 보고는 없다. 이것은 처리기술 자체가 know-how이기 때문에 기업이나, 국가에서 외부로의 누출을 꺼려하고 있기 때문이다.

본 연구에서는 자체의 처리기술의 확보를 위한 기초연구를 목적으로 하여 분해미생물을 분리하고, 분해특성을 규명하는 한편, 이들 분해미생물을 적당한 담체에 고정화 시켜서 분해율을 높이고자 하였다.

재료 및 방법

1. 균주 분리 및 특성

미생물 균주를 분리하기위하여 Carbon-minimal medium(C-배지)을 사용하였다2). 이때 탄소원으로는 PCBs 또는 Biphenyl을 사용한다. 분해 미생물을 분리해 내기 위해 하수종말처리장에서 채취한 폐수를 이용하였다. C-배지 (10□) 가 들어 있는 시험관에 채취한 폐수를 각각 100 □씩 넣어 30℃ 또는 37℃에서 일주일 동안 진탕배양하였다. 일주일 후 균이 자란 시험관을 선별해서 동일배지가 들어 있는 시험관에 1% 접종하고 다시 일주일간 배양하였다. 이것을 두 번 반복한 후 미생물균주를 분리하기 위하여 배양액 100 □를  LB 고체배지에 도말하여 균을 분리하였다. 분해균의 기질에 대한 특이성을 조사하기 위하여 C-배지에 유일한 탄소원으로 각종 방향족 화합물을 사용하여 균의 자화능력 여부를 조사하였다. 또한, 분리된 미생물이 PCBs를 분해할 때에 대사 과정에서 meta-개열에 관여하는 효소를 생산하는데, 이들 효소의 기질에 대한 특이성을 조사 하였다. 사용된 기질은 2,3-dihydroxybiphenyl, catechol, 3-methylcatechol, 4-methylcatechol이다.

2. PCBs의 추출 및 GC 측정

시료의 분석은 PCBs 분석에 관한 표준방법인 U.S. EPA505를 기초로 하여 GC/ECD (N0. 5890 Ⅱ plus; Hewlett Packard Co., Palo Alto, Cali) 를 이용하여 측정하였다. 컬럼은 HP-5MS (30m, 0.25mm, 0.25□)로 95%의 polydimethylsiloxane과 5% polydiphenylsiloxane 이 내부에 코팅된 컬럼을 이용하였으며, 이동상으로는 고순도 N2를 사용하였다. 컬럼내에 흐르는 유속은 30cm/s로, anode purging gas flow는 70ml/min로 하고, constant flow mode를 이용하였다. 컬럼의 온도는 100℃ (1min)에서 180℃까지는 15℃/min의 승온 속도로, 240℃까지는 2℃/min의 승온속도로 상승시켜 측정하였다. Injector와 detector의 온도는 각각 250℃와 300℃로 설정하였다. GC의 data처리는 HP3365 프로그램을 이용하였다.

3. NCO-프리폴리마의 조제 및 미생물의 고정

NCO-프리폴리마는 liquid MDI을 50℃에서 30분간 가열한 후, 폴리프로필렌 글리콜 (분자량 1000, 2000, 3000, 4000, 5000)을 소량씩 첨가하면서 4시간동안 반응시켜 합성하였다. 이때, 반응온도는 70∼80℃의 범위를 유지하였으며, 질소분위기하에서 진행하였다.

미생물을 탄소원으로 biphenyl 또는 p-chlorobiphenyl (100mg)이 들어 있는 C-배지 (100□) 에 접종하고, 30℃, 200 rpm의 shaking incubator에서 2 일간 배양한다. 그리고, 4,000 rpm에서 15분간 원심 분리시킨 후 생리식염수로 씻어 주고, 다시 현탁시켜서 UV/VIS 분광기를 이용하여 615nm에서 흡광도가 1.0이 되도록 미생물 농도를 맞춘다. 10% NCO-프리폴리머 (폴리프로필렌 글리콜, 분자량 2000, 3000)에 현탁된 미생물 액을 3% (w/w)정도 넣고, 계면활성제인 L-5305를 1% (w/w)를 넣는다. 혼합액을 2000rpm에서 3분간 교반시킨 후 30분간 상온에서 방치하면 발포되어 미생물이 고정화된 폴리우레탄 폼이 생성된다.

4. 분해 유전자의 cloning

PCBs분해에 관련된 유전자의 취득을 위하여 분해균주로부터 total DNA를 추출하였고, E. coli □DH5를 host로하고, vector DNA로는 pUC119를 사용하여 cloning을 하였다. DNA추출과 같은 유전자 조작은 상법에 준하여 실시 하였다3).

결과 및 고찰

1. 분류 및 동정

PCBs/biphenyl을 단일 탄소원으로 하여 분해균을 분리 검색한 결과 14 종의 분해균이 분리되었으며, 이들 모두 Gram 음성균이었다. 생물화학적인 실험을 하여 동정한 결과 Alcaligenes sp. (미생물 KS1∼KS6)와 Pseudomonas sp. (미생물 SY1∼SY8)로 분류되었다. 이들 균들은 모두 Pseudomonad를 선택적으로 분리하는 Pseudomonas Isolation Agar(PIA) plate에서 성장을 하였다. KS1에서 KS6, 그리고 SY1에서 SY8 으로 분류한 것은 이들 분해균들이 여러 가지 방향족화합물을 탄소원으로하여 배양했을 때, 서로 차이점을 나타내었기 때문에 이와같이 분류하였다.

2. 분해특성

호기성 미생물에 의한 PCBs/biphenyl의 분해 중간산물을 알아보기 위해 Alcaligenes sp. KS3와 Psedomonas sp. SY5를 선정하여 중간 산물을 GC/MS로 확인한 결과, biphenyl과 p-chlorobiphenyl은 이들 미생물에 의해 산화경로를 통해 각각 다량의 중간 산물로 benzoic acid와 p-chlorobenzoic acid로 된다는 것을 알 수 있었다.

3. 폴리우레탄 폼의 크기 결정 및 미생물의 고정화

미생물이 고정되는 담체의 효율성을 향상시키기 위해서 여러 가지 조건에서 폴리우레탄 폼의 동공 크기를 조절한 결과, 10% NCO-프리폴리머 (폴리프로필렌 글리콜의 분자량, 3000), 계면활성제는 1.2% (w/w)로, 교반속도는 2,000rpm으로 고정하였을 경우 첨가되는 물의 조성비 2∼5% (w/w)의 범위내에서 제조된 폼의 동공 크기는 200∼400 □정도로 적당하였다. 또한 전자현미경을 통하여 폼의 크기 및 미생물의 고정 여부를 관찰하였다. 관찰 결과 폼의 내부에 미생물이 고정되어 있는 것을 알수 있었고, 배양을 통하여 미생물의 수가 늘어나는 것으로 보아 폴리우레탄의 발포과정에서도 미생물이 생존 가능하다는 것을 알수 있었다.

4. 분해활성

고정화된 미생물과 고정화하지 않은 미생물을 사용하여 PCBs의 분해활성을 관찰한 결과 고정화된 미생물이 보다 더 안정된 성장을 보이고, 분해활성에 있어서도 뛰어나다는 것을 알수 있었다. 특히 염소이온이 많이 들어 있는 PCBs의 분해가 고정화된 분해미생물을 이용하였을 때 높은 분해율을 보였다. Table 1에 그 결과를 나타낸다. 또한 폴리우레탄 폼 자체가 PCBs를 흡착하는 사실을 알수 있었고, 이러한 특성을 이용하면, 토양이나 폐수중에 함유되어 있는  PCBs를 효과적으로 제거할수 있을 것으로 사료된다.

5. PCBs 분해관련 유전자의 cloning

분해능력이 뛰어난 균주를 선정하여 PCBs 분해에 관련된 효소의 유전자를 cloning한 결과, 제한효소에 의한 절단 부위가 상이한 두 개의 유전자를 취득하였다.

참고문헌

1. M. Maeda, S.Y. Chung, E. Song, and T. Kudo, (1995) Applied and Environmental Microbiology, 61(2), 549-555.

2. K.S. Na, Y.W. Lee, J.S. Lee, J.S. Lee, M. Kubo, and S.Y. Chung, (1998) Environ. Eng. Res., 3(2), 67-78.

3. Sambrook, J., E.F. Fritsch, and T. Maniatis, (1989) Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y.

Table 1. 비고정 미생물과 고정 미생물과의 PCBs 분해의 비교

Peak No.	PCB congeners	분 해 능 력 (%)
		비고정 미생물	고정 미생물
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38	2,6- & 2,2'- 2,5- & 2,4- 2.3'- 2,3- & 2,4'- 2,6,2'- 2,5,2'- 2,4,2'- & 4,4'- 2,6,3'- & 2,3,6- 2,6,4'- & 2,3,2'- 2,5,3'- 2,4,3'- 2,5,4'- & 2,4,4'- 3,4,2'- & 2,5,2',6'- 2,3,4'- & 2,4,2',6'- 2,3,6,2'- 2,3,2',6'- 2,5,2',5'- 2,4,2',5'- 2,4,2',4'- & 2,4,5,2'- 2,3,2',5'- 3,4,4'- & 2,3,2',4'- 2,3,6,4'- & 2,3,4,2'- & 2,6,3',4'- 2,3,2',3'- 2,3,4,2'5'- 2,5,3',4'- 2,4,3',4'- & 2,3,6,2',5'- 2,3,6,2',4'- 2,3,4,3'- & 2,3,4,4'- 2,3,6,2',3'- & 2,3,5,2',5'- 2,3,5,2',4'- & 2,4,5,2',5'- 2,4,5,2,4'- 2,4,5,2',3'- & 2,3,5,6,2',6'- 2,3,4,2',5'- 2,3,4,2',4'- 2,3,6,3',4'- & 3,4,3',4'- 2,3,4,2',3'- 2,3,6,2',4',5'- & 2,4,5,3',4'- 2,3,4,3',4'- & 2,3,4,2',3',6'-	100 100 100 100 100 95 95 100 90 85 100 80 80 100 70 60 55 50 50 50 45 45 40 25 30 25 25 25 30 15 10 15 10 0 10 5 0 0	100 100 100 95 100 85 85 100 90 100 100 90 90 95 85 100 85 85 85 80 75 75 75 60 55 55 25 45 30 25 45 35 35 30 20 20 0 0