재조합 효모를 이용한 Hirudin 생산공정의 최적화

김명동, 이태희, 이상기*, 서진호

서울대학교 식품공학과 및 농업생물신소재연구센터, 한국과학기술연구원 생명공학연구소*

Optimization of Fermentation Processes for Production of Hirudin by Recombinant Hansenula polymorpha

Myoung-Dong Kim, Tae-Hee Lee, Sang-Ki Rhee* and Jin-Ho Seo

Department of Food Science & Technology and Research Center for New Bio-Materials in Agriculture, Seoul National University, Suwon 441-744, Korea Institute of Bioscience & Biotechnology, Taejon 305-606*

서론

본 연구에서는 메탄올 자화효모인 Hansenula polymorpha를 이용한 항혈전성 단백질인 hirudin의 생산공정에 미치는 환경인자의 영향을 고찰하고 생산성 증진을 위한 연구를 수행하였다. 탄소원으로 glycerol, 포도당을 사용하였을 때 hirudin의 발현은 완전히 저해되었으며 각각의 탄소원이 고갈된 후에 derepression되는 경향을 보였다. 탄소원으로 포도당을 대사하는 과정에서 생성된 에탄올은 hirudin의 발현을 저해하였으며 15g/l이상의 메탄올도 균체의 성장과 hirudin 발현을 저해하였다. 최적의 균체 성장과 hirudin 발현을 유도할 수 있는 조건은 pH 5.0, 30℃로 각각 결정되었으며 메탄올을 탄소원으로 이용한 회분식, 연속식 및 유가식 배양의 결과 메탄올의 농도가 증가함에 따라 hirudin 발현이 저해되는 것을 확인하였다. 현재 유가식 배양을 이용한 hirudin 생산성 향상에 관한 연구를 수행 중에 있다.

재료 및 방법

균주는 hirudin 유전자가 포함된 plasmid pUAEM36으로 형질전환된 재조합 Hansenula polymorpha DLUV10을 사용하였다. pUAEM36은 MOX promoter/terminator로 구성되어 있으며 H. polymorpha에서 안정적으로 전사되는 데에 필요한 HARS36 서열을 포함하고 있다. 균주는 yeast nitrogen base(YNB)에 leucine을 첨가한 배지에서 보관하였으며, 필요에 따라 계대하여 사용하였다. 배양에 사용한 배지는 전배양에는 YNB 6.8g/l, leucine 30mg/l, glycerol 20g/l로 조성된 배지를, 발효기 배양에서는 30g/l yeast extract, 15g/l peptone, 3.4g/l YNB, 15g/l KH2PO4로 조성된 배지를 각각 사용하였다. 전배양은 rotary shaker에서 약 12시간 수행하였으며, 발효기(KF2.5L, 한국발효기)배양은 실험목적에 따라 300-600rpm, 1vvm으로 조건이었다. 연속식 및 유가식 배양에서 배지의 주입을 위하여 연동펌프를 사용하였다. 균체농도는 600nm에서의 흡광도를 이용하여 측정하였다. 포도당과 glycerol의 농도는 각각 영동제약과 Boerhinger Manheimm의 enzymatic kit을 사용하여 측정하였다. 에탄올과 메탄올은 Gas chromatograph(영린기기)에 Carbowax 20M 60/80 column을 장착하여 측정하였다. GC의 주입구와 검출기의 온도는 200℃였으며 column의 온도는 85-145℃범위에서 조정하여 사용하였다. 이동상 helium을 30ml/min의 유속으로 사용하였다. Hirudin activity는 37℃에서 1 NIH thrombin unit을 완전히 저해하는 hirudin의 양으로 정의하였다. Hirudin activity의 측정에는 인공기질인 chromozyme TH(BM)과 0.6 unit thrombin을 사용하였다.

결과 및 토론

고생산성 발효공정의 개발을 위한 탄소원을 결정하기 위하여 포도당, glycerol 및 메탄올을 각각 탄소원으로 이용한 회분식 배양의 결과, hirudin의 발현은 포도당, glycerol의 대사과정 중에 완전히 repression되는 것을 알 수 있었다(Fig. 1).

Fig. 1  Specific hirudin activities under glucose and methanol

이는 일반적으로 H. polymoprha에서의 외래 유전자의 발현 조절 양상으로 알려진 repression/derepression/induction와는 차이가 있었으며 오히려 Pichia pastoris에서의 외래 유전자의 발현양상과 유사하였다. 또한 포도당 대사과정에서 생산된 과량의 에탄올은 포도당의 고갈 후에 메탄올보다 우선적으로 대사되었으며 hirudin의 발현을 지연시키는 결과를 초래하였다. 메탄올을 탄소원으로 사용한 배양의 경우에는 약 3mg hirudin/g cell의 비효소역가를 나타내며 hirudin이 생산되었지만 균체의 성장속도가 포도당이나 glycerol에 비하여 다소 낮은 수준이었다. 따라서 이상의 회분식 배양의 결과로부터 에탄올이 과량으로 생성되지 않는 glycerol을 이용하여 균체를 성장시킨 후 메탄올을 이용하여 hirudin의 발현을 유도하는 2단계 발효전략을 수립할 수 있었다.

연속식 및 유가식 배양을 이용하여 최대의 hirudin 발현을 유도할 수 있는 메탄올의 농도를 결정하였다. 일정한 희석속도에서 주입하는 메탄올의 농도를 변화시키거나 주입하는 메탄올의 농도를 일정하게 하고 희석속도를 변화시키는 연속배양의 결과로부터 최대의 hirudin발현을 유도할 수 있는 최적의 메탄올농도가 존재함을 알 수 있었다(Fig. 2). 주입메탄올의 농도를 5g/l로 고정한 연속식 배양의 경우 약 0.08h-1의 희석속도에서 최대의 hirudin activity를 나타내었으며 희석속도를 증가시킴에 따라 메탄올농도가 증가하여 specific hirudin activity는 감소함을 알 수 있었다. Fig. 2에서 알 수 있듯이 본 연구에서 사용한 hirudin 생산용 재조합 효모의 경우는 낮은 비메탄올농도에서 높은 specific activity를 보이므로 메탄올을 성장을 위한 탄소원과 hirudin 발현을 위한 유도제로 동시에 사용하는 발효공정보다는 메탄올 이외의 탄소원으로 균체의 성장을 유도하고 메탄올을 hirudin의 발현유도제로 사용하는 것이 타당할 것으로 사료되었다. 즉, 과량의 에탄올을 생성하지 않는 glycerol을 이용하여 빠른 속도로 고농도의 균체성장을 유도하고 hirudin의 발현을 위하여 메탄올을 제한적으로 공급하는 2단계 유가식 발효전략이 타당할 것이다. 현재 hirudin의 생산성을 증가시키기 위한 유가식 발효공정을 개발 중에 있다.

Fig. 2  Profile of specific hirudin activity and specific methanol

결론

메탄올 자화효모인 재조합 Hansenula polymorpha를 이용한 hirudin 생산공정에 관한 연구에서 탄소원으로 사용한 포도당과 glycerol은 hirudin의 발현을 저해하였으며 고농도의 메탄올은 균체의 성장과 hirudin의 발현을 저해하였다. 또한 포도당 대사과정에서 생성되는 과량의 에탄올에 의한 hirudin의 발현저해도 관찰되었다. 회분식 배양의 결과 glycerol과 메탄올을 이용한 2단계 발효공정이 타당함을 알 수 있었고 균체의 성장과 hirudin 생산을 위한 최적의 발효조건은 pH 5.0, 30℃였다. 연속식 및 유가식 배양의 결과 고농도의 메탄올에 의한 hirudin 발현저해 현상을 확인할 수 있었다.

참고문헌

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