Ultrafiltration을 이용한 □-Cyclodextrin의 회수

장 우 진, 구 윤 모

인하대학교 공과대학 생물공학과

Recovery of □-Cyclodextrin using Ultrafiltration

Woo-Jin Chang, Yoon-Mo Koo

Department of Biological Engineering, Inha University, Inchon, Korea

서론

Ultrafiltration은 일정한 pore size의 membrane에 압력, 진공, 중력 등의 힘을 적용하여 물질의 크기에 의해 농축, 정제하는 방법이다(1).  수성이상계 추출은 수상계에서 고분자와 고분자 또는 무기염 사이의 incompatibility에 의해 생긴 서로 섞이지 않는 2개의 상에서 목적 물질의 선택적 분배를 바탕으로 하는 기술로, 최근 세포내 단백질의 분리, 효소적 생전환, acetone-butanol 발효 등에 널리 이용되고 있다(2).  수성이상계를 이용한 물질 분리의 경우 수상계 내에는 분리하고자 하는 목적 물질과 상 형성에 사용한 고분자 물질이 함께 존재한다.  이러한 수상계로부터의 목적 물질 분리에 ultrafiltration을 이용할 수 있다.

Cyclodextrin의 분배 계수가 서로 다른 수성이상계 내에서의 cyclodextrin 생산과 동시 분배에 관한 연구(3)에 의하면 cyclodextrin 분배상에는 starch, CGTase, cyclodextrin, PEG 등의 물질이 존재한다.  본 연구에서는 기존 연구 결과를 바탕으로 분배상의 조건을 형성하여 ultrafiltration을 이용한 cyclodextrin의 정제 가능성에 관하여 연구하였다.,

실험방법

분배상과 같은 조건 형성을 위해 10%(w/v)의 PEG(Yakuri pure chemical co., 분자량 20,000)를 포함하는 pH 6.0, 20mM sodium phosphate buffer solution에 □-cyclodextrin(Sewon co.), CGTase(Amano pharmaceutical co.)를 용해시킨 용액을 사용하였다.  PEG 10%(w/v) solution 내에 □-CD는 2mg/ml, CGTase는 3.2□l/ml의 농도로 용해시켜 사용하였다.

Ultrafiltration 장치로는 stirred cell 8400(Amicon co.)과 Amicon사의 PM10(MWCO 10,000), YM2(MWCO 2,000) membrane을 이용하였으며, 압축 공기를 이용하여 압력 3.0 kg/cm2으로 가압하였고, magnetic stirrer를 이용하여 agitation speed 150rpm으로 mixing하였다.

□-CD는 HPLC(Orom tech. co.)와 Nova pak column(Waters co.), RI detertor(Waters co.)를 사용하였으며, 용출용매로 acetonitrile과 water(70:30) 혼합용액을 용액속도 1.5ml/min으로 하여 분석하였다.  PEG 농도는 spectrophotometer(Shimadzu co.)를 사용하여 파장 290nm에서 분석하였고, CGTase 농도는 Bradford 방법을 사용하여 측정하였다(3).

Ultrafiltration 후 각각의 물질에 대한 rejection coefficient는 filtrate와 retentate의 농도를 측정하여 1 - Cfiltrate/Cretentate의 식에 의하여 구하였다.

결과 및 토론

MWCO 10,000인 PM10 membrane을 이용하여 분자량 20,000인 PEG 10% solution(w/v)에 □-CD와 CGTase 각각을 2mg/ml, 3.2□l/ml의 농도로 용해시켜 flitration 결과를 관찰하였다.  Fig. 1에서 filtrate에서의 □-CD 농도는 약 2mg/ml로 초기 용액에서의 농도와 동일하였다.  또한 Flux는 240분 이후 60% 감소하였다.  그러나 분자량 20,000인 PEG가 초기 용해량의 80% 농도로 filtrate에 존재하는 것이 관찰되었다.  이것은 membrane pore size와 PEG 분자량의 평균값 주변에서의 분포에 의한 결과로 판단된다.  CGTase의 경우 분자량이 80,000으로(5) 본 실험에서 filtrate에 존재하지 않을 것으로 예상하였으나 초기 용해량의 약 70%의 농도로 존재하였다(Fig. 2.).  이런 현상의 원인으로는 membrane의 손실과 분석상의 오류 등을 생각할 수 있다.  이것은 운전 압력의 감소와 filtrate의 CGTase activity 측정을 통해 확인할 수 있을 것으로 사료된다.  또한 Fig. 1에서와 같이 PEG가 filtrate에 존재하는 것으로 나타났으며, flux도 240분 이후 60% 감소하였다.  상기의 결과로 본 연구의 목적인 분자량 20,000인 PEG로 구성된 수성계에서의 □-CD 정제에 MWCO 10,000인 membrane을 사용하는 것은 정제 효율이 낮을 것으로 판단된다.

이후 MWCO 2,000인 YM2 membrane을 사용한 결과를 관찰하였으며 그 결과를 Fig. 3에 도시하였다.  Flux는 PM10에 비해 평균 50% 적었다.  □-CD의 경우 초기 용액에서의 농도의 33% 수준인 평균 0.7mg/ml의 농도로 filtering되었으며, 분자량 20,000인 PEG가 5%의 농도로 filtrate에 존재하는 것을 확인하였다.  본 결과로 볼 때 PEG의 분자량 분포에 관한 확인 과정이 좀 더 필요한 것으로 판단되며,  운전중 PEG의 절단에 의한 작은 분자량의 PEG 생산도 그 원인으로 생각할 수 있다.

상기의 결과로 각 실험에서의 rejection coefficient를 Table 1에 나타내었다.  PM10 membrane에서 CGTase의 rejection coefficient는 □-CD의 약 2배로 나타났다.  Membrane pore size가 1/5인 YM2의 경우 □-CD와 PEG의 rejection coefficient가 약 2배 증가하였으며, CGTase는 30% 정도의 증가를 보였다.  그러나 PEG의 경우 filtering 효과가 높지 못하였다.  본 연구의 결과, PM10은 본 연구의 목적상 적합하지 않은 것으로 판단되며, 그 해결 방안으로는 pore size가 좀 더 작은 membrane을 사용하는 방법과 PEG 분자량 분획 후 사용하는 방법, 그리고 용량이 큰 hollow fiber를 이용하여 낮은 압력에서 운전하여 cyclodextrin 이외의 물질에 대한 filtering 효과를 높이는 방법 등을 생각할 수 있다.  또한 본 결과는 PEG의 경우와 같이 분자량이 정확하지 못한 경우에서의 ultrafiltration시 membrane 선정에 하나의 고려 사항 제시의 의미가 있는 것으로 사료되며, 이에 대한 보완 연구가 필요한 것으로 판단된다.

참고문헌

(1) M. P. Deutscher, "Methods in Enzymology, Guide to Protein Purification", Vol. 182, 75(1990)

(2) S. H. Kim, Y. J. Yoo, J. Ferm. Bioeng., 71(5), 373(1991)

(3) K.-H. Min, Y.-M. Koo, Biotechnol. Techniques, 10(6), 395(1996)

(4) D. M. Bollag, S. J. Edelstein, "Protein Methods", 50(1991)

(5) K.-A. Sin, A. Nakamura, K. Kobayashi, H. Masaki, T. Uozumi, Appl. Microbiol. Biotechnol., 35, 600(1991)

Table 1. Rejection coefficients of each materials in the experiments.

	□-CD	CGTase	PEG
□-CD/PEG(PM10)	0.375	-	0.158
CGTase/PEG(PM10)	-	0.611	0.132
□-CD/CGTase/PEG (YM2)	0.692	0.896	0.360