재조합 Alcaligenes eutrophus에 의한 Poly(3-hydroxybutyrate)의 생산

최 종일, 이 상엽

한국과학기술원 화학공학과

Production of Poly(3-hydroxybutyrate) by Recombinant Alcaligenes eutrophus

Choi, Jong-il and Lee, Sang Yup

Department of Chemical Engineering, Korea Advanced Institute of Science and Technology

서론

플라스틱은 석유화학 공업과 고분자 합성 관련 기술의 발달로 고무와 같은 탄성체에서부터 높은 강도를 가진 물질에 이르기까지 넓은 응용범위에서 사용되어져왔다. 이러한 합성 플라스틱은 일상생활에 편리함을 주었지만, 자연계에서 분해되지 않는 반영구적인 성질로 인하여 심각한 환경문제를 야기시키고 있다. 이러한 환경문제의 하나의 해결책으로써, 기존의 석유합성 플라스틱을 대체할 수 있는 생분해성 플라스틱의 개발을 위한 연구가 전세계적으로 수행되고 있다. 현재 연구되어지고 있는 여러 생분해성 고분자들 가운데서 polyhydroxyalkanoates (PHA)는 과잉의 탄소원 존재 하에 성장에 필요한 영양분이 제한될 경우 많은 미생물들이 탄소원 및 에너지 저장 물질로써 축적하는 polyester 물질이다. 가장 널리 알려진 poly(3-hydroxybutyrate) [P(3HB)] 이외에 단량체인 hydroxyalkanoate의 형태에 따른 많은 PHA들이 보고되었으며, 300 여종 이상의 미생물들이 PHA를 생합성할 수 있는 것으로 알려져있다. PHA는 현재 상용되고 있는 석유합성 고분자와 유사한 기계적 물성을 가지며, 자연환경하에서 완전한 생분해가 일어나기 때문에 합성 고분자의 대체 물질로서 많은 관심을 끌고 있다 [4, 5]. PHA는 영국의 ZENECA Bio Products에서 상업적으로 생산되어 BiopolTM의 상표명으로 시중에 나왔었으며, 일회용 면도기나 샴푸병과 같은 용도로 사용되고 있다. 하지만 bulk product로써 PHA의 상용화는 높은 생산단가로 인한 문제점을 가지고 있다. 이러한 높은 생산 단가의 절감을 위해 신규 PHA 합성 균주의 분리, 합성 균주의 개발, 고효율 생물학적 생산 (발효) 기술 연구, 경제적인 분리·정제 공정의 개발 등에 관한 연구가 전세계적으로 진행되고 있다 [4, 5].

본 연구에서는 P(3HB) 생산 균주로써 가장 잘 알려진 Alcaligenes eutrophus를 이용하여 재조합 DNA 기술로 고생산성으로 P(3HB)를 합성할 수 있는 재조합 A. eutrophus를 개발하고, 개발된 재조합 A. eutrophus에 의한 P(3HB) 합성을 실험하였다. P(3HB) 생합성능이 향상된 재조합 A. eutrophus를 개발하기 위하여, A. eutrophus내의 PHA 생합성에 관련되는 효소들을 coding하는 genes을 가지는 vector로 A. eutrophus를 형질전환하여 PHA 생합성 관련 효소들의 homologous amplification에 의한 재조합 A. eutrophus의 개발을 연구하였다. 또한 A. eutrophus의 형질전환을 위해 요구되는 vector의 제작과 형질전환 기술의 확립에 관해서도 연구하였다.

실험 방법

Bacterial strains and plasmid DNAs

P(3HB) 생산 균주로써 A. eutrophus NCIMB 11599를 이용하였다 [2]. 재조합 A. eutrophus의 제작을 위하여 사용한 plasmid로는 broad-host-range plasmid pVK101을 이용하였다. A. eutrophus PHA 생합성 유전자는 Schubert등 [6]이 A. eutrophus H16에서 cloning한 PHA synthase, □-ketothiolase, NADPH dependent acetoacetyl-CoA reductase (phaC-A-B)를 모두 가지고 있는 genomic DNA fragment를 사용하였다.

Culture condition

실험에 사용된 배지는 탄소원으로써 glucose를 포함한 R 배지 (pH 6.8)를 사용하였다 [2].

Flask 배양은 250 mL의 erlenmeyer flask를 이용하여 30 ℃에서 50 mL 배지에 균주를 배양하여 실험하였다. 발효기를 이용한 회분식 배양은 2.5 L의 jar fermentor (한국 발효기)를 이용하여 실험하였으며, pH 조절은 4 N NaOH를 사용하였다.

Analytical procedures

건조균체 농도 (dry cell mass concentration)는 배양액의 일정 부피를 원심분리하여 상등액은 버리고, dry oven에서 세포 무게가 더 이상 변하지 않을 때까지 건조시킨 후 측정하였다. P(3HB)의 분석은 Braunegg등 [1]이 개발한 방법을 변형하여 사용하였다. 잉여 건조균체 농도 (residual cell mass concentration)는 건조균체 농도에서 P(3HB) 농도를 뺀 것으로 정의하였다. P(3HB) 함량은 건조균체 농도에 대한 P(3HB) 농도의 백분율로 나타내었다.

PHA 생합성 관련효소들의 활성도는 Lee등 [3]의 방법을 이용하여 PHA 생합성에 관계하는 □-ketothiolase와 acetoacetyl-CoA reductase에 대해서 측정하였다.

결과 및 토론

재조합 Alcaligenes eutrophus의 제작

재조합 A. eutrophus를 개발하기 위하여 먼저 A. eutrophus에서 복제능을 가진 vector를 제작하였다. 여러 plasmid들이 Alcaligenes의 형질 전환을 위하여 사용되었으나, 본 연구에서는 여러 균주들에서 복제가 가능한 broad-host-range plasmid pVK101을 이용하여 vector를 제작하였다. pVK101에 이미 cloning된 A. eutrophus H16의 PHA 생합성 관련 효소들을 coding하는 genes을 삽입하여 homologous amplification에 의한 재조합 A. eutrophus를 위한 vector로 사용하였다. Fig. 1은 이렇게 하여 만들어진 vector를 나타낸다.

이러한 vector를 가지고 electroporation에 의한 방법으로 A. eutrophus를 형질전환하였다. 형질전환에 미치는 여러 인자들을 최적화 하였을 때 이 vector에 의한 A. eutrophus의 형질전환 효율은 103 transformant/□g DNA의 값을 가졌다.

재조합 Alcaligenes eutrophus에서의 P(3HB)의 합성

A. eutrophus는 과량의 탄소원 존재하에 질소원과 같은 영양분이 제한될 경우 P(3HB)를 합성·축적하기 때문에 질소원에 대한 탄소원의 비율은 세포 성장과 P(3HB) 합성에 큰 영향을 끼친다. PHA 생합성 유전자를 가진 vector로 형질전환된 재조합 A. eutrophus의 경우에 대해서 질소원에대한 탄소원의 몰비율 (C/N 몰비율)에 따른 영향이 실험되었다. C/N 몰비율이 증가할수록 P(3HB)의 함량은 증가하지만 최종적으로 얻어지는 세포 농도와 P(3HB)의 농도는 낮은 값을 가졌으며, C/N 몰비율이 낮을 경우에는 비록 높은 세포 농도를 얻을 수 있었지만 낮은 P(3HB) 농도를 가지게 된다. 적절한 C/N 몰비율에서 가장 높은 P(3HB) 농도를 얻을 수 있었다. 이러한 경향은 wild type A. eutrophus에서와 같은 경향으로써, 고농도의 P(3HB)를 높은 함량으로 얻기 위해서는 먼저 적절한 세포 농도까지 영양분제한 없이 성장시킨 후, 그 후에 영양분제한의 조건으로 P(3HB)를 생합성해야한다. Fig. 2는 C/N 몰비율에 따른 세포농도와 P(3HB) 농도를 나타낸다.

PHA 생합성 유전자를 가진 vector로 형질전환된 재조합 A. eutrophus와 원래의 wild type A. eutrophus의 세포 성장과 P(3HB) 합성능을 비교하기 위하여 발효기 내에서의 회분식 배양을 실험하였다. R 배지에서 탄소원으로 glucose 20 g/L로 하였을 때, 시간에 따른 세포 농도와 P(3HB)의 농도는 Fig. 3과 같다. 최종 세포 농도와 P(3HB) 농도는 재조합 A. eutrophus의 경우 9.5 g/L 세포 농도, 6.35 g/L의 P(3HB)를 나타내었고, wild type A. eutrophus의 경우 9.5 g/L의 세포 농도와 6 g/L의 P(3HB)의 농도를 나타내었다. 최종 세포 농도에 대해서는 재조합 A. eutrophus와 wild type A. eutrophus가 거의 같은 농도를 보였고, P(3HB)의 농도는 재조합 A. eutrophus가 wild type보다 약간 높은 값을 가졌다. 잔여 세포 농도는 재조합 A. eutrophus에서 더 낮은 값을 가졌다. 재조합 A. eutrophus가 wild type A. eutrophus보다 높은 P(3HB) 함량을 가지고 있는 것으로 나타났다. P(3HB)의 생산성 면에서는, 재조합 A. eutrophus가 wild type보다 높은 생산성을 가지고 있었다. 또한 A. eutrophus와 wild type 균주에서 시간에 따른 PHA 생합성 관련 효소인 □-ketothiolase와 acetoacetyl-CoA reductase의 효소 활성도를 측정한 결과, 재조합 A. eutrophus에서의 효소 활성도가 wild type보다 2 배 이상 증가하였다.

참고 문헌

1. Braunegg, G., Sonnleitner, B., Lafferty, R. M.: Eur. J. Appl. Microbiol. Biotechnol. 6:29-37 (1978).

2. Kim, B. S., Lee, S. C., Lee, S. Y., Chang, H. N., Chang, Y. K., Woo, S. I.: Biotechnol. Bioeng. 43: 892-898 (1994).

3. Lee, I. Y., Kim, M. K., Park, Y. H., Lee, S. Y.: Biotechnol. Bioeng. 52: 707-712 (1996).

4. Lee, S. Y.: Biotechnol. Bioeng. 49: 1-14 (1996).

5. Lee, S. Y.: Trends Biotechnol. 14: 431- 438 (1996).

6. Schubert, P., Steinbuchel, A., Schlegel, H. G.: J. Bacteriol. 170: 5837-5847 (1988.).