고분자표면의 개질에 의한 신경세포 점착제어 및 미세패턴화

류 상 욱, 김 도 균, 이 재 석

광주과학기술원 신소재공학과

Adhesion control and micropattern of Neuroblastoma on the modified polymer surfaces

Sang-Woog Ryu, Do-Kyoon Kim, Jae-Suk Lee

Department of Materials Science and Engineering

Kwangju Institute of Science and Technology

서론

고분자표면에서 생체물질의 점착에 대한 연구는 의료용 재료에의 응용을 위해 많이 진행되어 왔다1. 나아가서 고분자 표면을 개질 하여 세포 및 단백질의 점착을 제어하여 생체소자에의 응용을 고려하고 있다2. 즉 재료 표면을 부분적으로, 물리적 처리 또는 화학적 방법에 의해 개질 하여, 생체물질을 재료 표면상에서 임의로 배열 제어하는 연구가 활발히 진행되고 있다. 이러한 연구결과 UV, 엑시마 레이저에 의한 표면의 화학적 개질과 배양세포의 패턴화3, 물리적 에칭에 의해 형성된 3차원 입체구조에 신경회로의 형성시도4 및 이온주입으로 개질 된 재료표면의 미세패턴화5,6등이 보고되고 있다. 합성고분자를 이용한 인공 세포기질은 복잡한 구조의 생체 세포기질과는 달리 물리 및 화학적 기능의 조절을 통하여 세포와의 점착력을 조절할 수 있다. 특히 인공세포 기질은 인위적 자극을 줌으로써 세포의 점착, 성장, 이동, 분화를 조절할 수 있는 장점을 가지고 있다. 그러나, 생체물질이 대기조건하에서 안정하지 못할 뿐만 아니라, 생체물질과 기질과의 점착성이 약하므로 장시간 소자로써 기능을 유지할 수 없다는 이유 등으로 연구가 활발하지 못하고 있다.

본 연구에서는 합성 고분자를 인공기질로 사용하여 세포를 배양하고 세포의 점착 및 성장을 관찰하였다. 또한 다양한 방법으로 표면개질하고 점착마스크를 사용하여 표면의 미세패턴화를 행한 후, 그 위에 세포를 배양하였다. 생체소자에 응용하기 위한 기초연구로 세포와 점착성이 약한 기질 위에 무기물질을 증착시켜 세포의 점착성을 조절함과 동시에 세포의 패턴화를 시도하였다.

실험

재료

기질로 사용한 고분자는 polystyrene(PSt), oxygen plasma treated polystyrene(O-PSt), poly(3-methacryoxypropyltrimethoxysilane)(PMATS), poly(methyl methacrylate)(PMMA), poly(MATS-co-MMA) 등을 사용하였다. PSt는 세포배양용 디쉬를 사용하였으며, PMATS, PMMA, copolymer는 라디칼 중합에 의해서 합성하였다. 고분자 단량체인 MATS는 CaH2를 사용하여 감압증류한 후에 사용하였으며, MMA는 NaOH 5%수용액으로 두 번 세척한 후 물로 잔존 염기를 제거하였다. 이후 건조제로 MgSO4를 사용하여 24시간동안 건조시키고 감압증류하여 사용하였다. 개시제로 사용되어진 2,2-azobisisobutyronitrile (AIBN)은 메탄올에 재결정한 뒤 사용하였다. 용매로 이용된 톨루엔은 황산을 사용해 세척하였으며 잔존하는 황산을 물로 제거하였다. 그 뒤  P2O5를 사용하여 증류시킨 뒤 중합에 사용하였다.

세포는 mouse neuroblastoma N18TG-2와 rat glioma C6Bu-1을 복합화한 NG108-15 neuroblastoma를 사용하였다. 배지로는 Dulbecco's Modified Eagle Medium(D-MEM, GIBCO BRL.)과 Fetal Bovine Serum(FBS, heat inactivated, GIBCO BRL.)을 적당한 비율로 섞어서 사용하였으며 HAT supplement(10mM Sodium Hypoxanthine, 40□M Aminopterin, 1.6mM Thymidine , GIBCO BRL., lyophilized, 100X)는 멸균수로 100X 용액을 만들어서 사용하였다. 완충 용액으로는 pH가 7.4인 Phosphate Buffered Saline(PBS)용액을 제조하여 사용하였다.

기질의 합성

단량체인 MATS, MMA는  톨루엔과 AIBN을 사용하여 각각 65℃에서 24시간 동안 단독중합하여 인공기질로 사용하였다. 반응이 끝난 뒤 비용매로 메탄올을 사용하여 합성된 고분자를 침전시킨 뒤, 여과후 벤젠에 용해시켜 동결건조 하였다. PMATS의 물성을 개선하고자 실시된 MATS와 MMA의 공중합은 앞의 과정과 동일하게 시행하였다. 도입되는 MATS와 MMA의 몰비는 1:4로 유지하였고, 첨가된 AIBN의 양은 도입된 전체 단량체에 대하여 1:200(w/w)으로 하였다.

NG108-15세포의 배양

실험에 사용되어진 NG108-15는 D-MEM에 FBS를  용해시켜 만든 5% FBS용액에 100X HAT supplement를 혼합시킨 것을 배지로 사용하여, 표면이 개질된 인공기질위에 배양하였다. 먼저 준비한 고분자를 코팅한 페트리디쉬(27mm, glass)에 배지 1.5ml를 넣고 7.5×104 (5×104개/ml)개의 신경세포를 seeding하였다. 그 뒤 37℃, 10% CO2 분위기 하에서 배양하고 3-4일 간격으로 split시켜 주었다. 점착된 세포의 수는 hemocytometer를 사용해 3번 측정한 뒤, 평균을 하여 구하였다. 또한 각각의 경우에 대한 세포의 점착과 증식의 경향을 2시간, 1일, 3일경과 후 위상차 현미경을 사용하여 관찰하였다.

기질의 패턴화

미세패턴화를 위해 본 실험에서는  페트리디쉬위에 각종 고분자 기질을 코팅한 후, 그 고분자 표면을 마스크를 사용하여 부분적으로 개질 하였다. 결과적으로 마스크에 의해 가리어진 부분은 고분자표면이 개질없이 그대로 유지되고 노출된 부분은 개질된 표면을 가지게 된다. 이러한 기질 위에 신경세포를 배양하여 미세패턴화를 시도하였다.

결과 및 토론

세포와 기질과의 상호작용

합성된 고분자 PMATS, 공중합체 poly(MATS-co-MMA)와 PMMA를 기질로 하여 신경세포를 배양한후 관찰하였다. 또한 초기 점착의 특성을 살펴보기 위하여 2시간 후의 점착 세포 수를 세어 관찰한 결과, PSt와 O-PSt의 경우에 비해서 PMMA, poly(MATS-co-MMA), PMATS는 세포의 초기 점착력이 좋지 않은 것으로 나타났다. 그 중 PSt는 3일 경과후 O-PSt와 비숫한 세포 형태와 증식을 보였다. 이는 세포가 PSt기질 위에서 서서히 점착하고 증식하기 때문이다. 또한, PMMA, PMATS, 공중합체 위에서는 초기에 대체로 증식성이 동일하게 좋지 않았으나, PMMA위에서는 3일 경과 후에 약간의 증식성을 보였다. 이러한 점착특성을 그림1에 나타냈다.

이는 PMMA와 비슷한 화학 구조의 고분자 기질 위에서 세포의 점착 및 증식 특성이 비슷하게 나타났으며, 특히 알콕시 실릴기를 갖는 기질 표면 위에서는 양호하지 못한 점착 특성을 갖고 있는 것으로 나타났다. 알콕시 실릴기를 갖는 기질은 field effect transistor(FET)7 등의 소자재료에서 금속 표면에 존재하는 수산기와의 공유결합에 의해 안정된 코팅이 가능하고, 그 위에 표면개질하여 미세패턴화가 가능할 것이다.

a) PSt                          b) O-PSt

c) PMMA                  d) PMATS             e) Poly(MATS-co-MMA)

그림1. 인공기질에 대한 NG108-15세포의 점착과 증식

(3일경과, 위상차 현미경,×100, bar=100 □m).

배양세포의 패턴화

개질된 표면과 미개질된 표면사이의 점착력 차를 이용하여 형성시킨 배양세포 미세패턴의 결과를 그림2에 나타냈다. 배양세포가 산소 프라즈마에 의해서 개질된 PSt 표면에서는 잘 점착하여 자라지만  개질되지 않은 PSt표면에서는 배양 초기에 잘 점착하지 않기 때문에 선명하게 미세패턴을 얻을 수 있다. 이는 여러 가지 기질 중 초기 점착력의 차이가 큰 재료를 2차원 표면에 같이 존재시켜 배양세포의 패턴을 얻는 방법이다. 즉 고분자 재료 표면을 물리 및 화학적 수단에 의하여 개질 하면 신경세포의 점착성 및 증식성이 제어될 수 있다. 더나아가 점착 및 증식이 가능한 표면으로 이루어진 회로 위에 신경세포의 돌기를 형성하게 함으로써 배양 신경세포에 의한 신경회로가 가능하다는 것을 의미한다.

그림2. 배양세포의 마이크로 패턴(3일경과, 위상차 현미경,×100, bar=100 □m).

감사

한국과학재단의 부분적 재정지원(Contract No.95-0502-06-03-3)에

감사드립니다.

참고문헌

1. Ratner, B. D.: J.Biomed. Mater. Res., 27, 837(1993).

2. McAlear, J. H. and  Wehrung, J. M.: “Molecular Electronic Devices”,      Marcel Dekker, New York, 175(1982).

3. Klieinfield, D., Kahler, K. H. and Hockberger, P. E.: J. Neurosic.

8, 4098(1988).

4. Hirono, T., Torimitsu, K., Kawana, A. and Hukuda, J.: Brain Res., 446

189(1988).

5. Suzuki, Y. et al.: Nucl. Instrum. Methods, B65, 142(1992).

6. Lee, J.-S. et al.: Biomaterials, 14, 958(1993).

7. Peter Fromherz, Andreas Offenausser, Thomas Vetter, Jurgen Weis :

Science, 252, 1290(1991).