Catalase를 이용한 메탄올 측정용 바이오센서의 제작

주  현, 김 성홍, 유 영제

서울대학교 화학공학과

Construction of Methanol Biosensor using Catalase

Hyun Joo, Sung Hong Kim, Young Je Yoo

Department of Chemical Engineering, Seoul National University

Seoul 151-742, Korea

서  론

공업적으로, 또는 의약이나, 식품산업에서 알콜의 농도를 빠르게, 정확하게 선택적으로 측정하는 일이 필요하다. 선택성이 높은 효소를 이용해 동적응답을 그대로 정보화할 수 있다면, 기존의 알콜 산화효소나, 알콜탈수소화 효소를 이용한 비싸고 낮은 선택성을 가진 알콜 센서를 대체할 수 있다.

본 연구에서는 값싸고, 반응시간도 매우 빠르며 알콜류에 대한 선택성이 뛰어난 catalase를 이용하여 메탄올을 감지하는 것이 가능한가를 알아보았고, 실제로 고정화시킨 catalase를 이용하여 메탄올의 농도를 측정한 결과 빠른 응답시간 (대략 60초 이내) 및 선형화된 결과가 얻어질 수 있음을 확인 할 수 있었다.

Catalase는 본래 과산화수소를 산화시켜 산소를 발생하는 효소인데, 이 중간 산화상태인 Compound-I 이 과산화수소와 알콜을 경쟁적으로 반응할 수 있다. 과산화수소와 반응하여 생기는 산소의 양이 알콜의 존재로 인해 줄게 되므로, 이를 감지하면 DO 전극으로 알콜농도를 측정할 수 있음을 앞선 실험에서 확인한 바 있는데, 이는 에탄올에 국한 된 연구였다[1].

본 연구에서는 센서의 확장성을 위하여 고정화된 catalase를 이용하여 메탄올의 농도 측정에 대한 실험을 시도하였다. 현재까지 메탄올 측정용 바이오센서의 제작 성공예는 아직 보고되어 있지 못한 실정이다. 그 이유는 생체내 혹은 미생물계에서 작용되는 효소중 메탄올과 반응성을 보이는 예는 드물기 때문이다. 센서의 제작에 있어 초기에는 UV 흡광기로 비교적 결과가 잘 나오는 메탄올과 과산화수소의 농도를 결정한 후 이 농도범위에서 DO전극으로 간단한 센서를 만들어 실험하였다.

실험결과로, 본 연구에 사용된 catalase는 메탄올에 대하여 반응성이 존재함을 알 수 있었으나, 과산화수소의 양이 너무 많으면 기질 저해 작용이 있으며, 메탄올의 농도가 너무 높으면 반응 속도가 떨어지고, 그 기울기도 변화하는 등 저해작용이 있음을 알 수 있었다. 또한 과산화수소와 알콜의 농도가 높을 때 동적응답곡선이 오버슈트하는 현상 등을 확인할 수 있었다.

Catalase 반응의 이론적 고찰

Catalase (EC 1.11.1.6)는 과산화수소를 산소로 촉매작용하는 효소이다. 그러나, 알콜이 존재시는 다음과 같은 기작을 따른다[2],[4].

[eqn: & rm ENZ-Fe sup 3+ + H sub 2 O sub 2 → Cpd-Fe sup 4+ cation~radical~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~(1) #& rm Cpd-I-Fe sup 4+ cation~ radical + H sub 2 O sub 2 →ENZ-Fe sup 3+ + H sub 2 O + O sub 2 ~~~~~~~~(2) #& rm Cpd-I-Fe sup 4+ cation~radical +alcohol →ENZ-Fe sup 3+ + H sub 2 O + aldehyde~(3)]

먼저 catalase가 과산화수소의 존재하에서 활성중심이 철 3가 양이온에서 철 4가 양이온으로 변화한다. 이것을 Cpd-I-[Fe3+]라 하고 (1), 두 번째 반응 (2),(3) 에서 과산화수소와 알콜이 경쟁적인 반응을 한다. 만일 알콜이 없다면 산소가 발생하지만, 알콜이 존재할 때는 알콜의 양에 따라 산소의 발생량이 감소한다. 따라서 발생되는 산소의 양을 측정하여 알콜의 양을 역으로 측정할 수 있는 것이 이번 연구의 주된 개념이다.

실  험

측정에 사용된 알콜종류는 크게 2종류, 즉 메탄올과 에탄올을 가지고 실험하였고, 산소 발생량과 과산화수소의 소모량을 측정하는데, UV-spec.과 발생된 산소의 양을 재기 위해 DO 전극을 이용하였다. Catalase의 농도는 0.5-1.2 □M의 범위에서 만들었다. 알콜 촉매전환용으로 사용된 catalase는 선택성이 매우 좋은 반면, 효소의 안정성에 상당한 문제가 있음을 발견하였다[3]. 더욱이, 초기 실험에 사용되었던 BLC (bovine liver catalase)는 값이 싼 반면 메탄올 기질에 대한 안정성이 급격히 저하함을 알 수 있었다. 따라서 이러한 활성 저하를 막기 위하여 4% 의[eqn: rm (NH sub 4 ) sub 2 SO sub 4] 와 agarose 를 이용하여 gel 안에 포괄법으로 고정화된 catalase (Sigma, St. Louis, MO)시스템을 도입하였다.

결과 및 토론

결론적으로 catalase의 반응특성 분석에 있어 과산화수소와 알콜간에는 경쟁적인 반응이 존재하며, 과산화수소와 catalase 사이에 일어나는 반응을 이용하여 센서에의 응용가능성을 검토하였다. 본 연구의 주안점은 catalase를 이용하여 메탄올과의 반응성 여부 및 DO전극으로 알콜농도의 검출을 빠른 시간안에 수행할 수 있는지의 여부였다. 이때 속도에 영향을 주는 인자는 센서에 사용된 효소의 양과 알콜류와 동시에 공급되는 과산화수소의 농도이다. 결과로, 저 농도의 과산화수소가 공급시, 반응이 미비하여 산소 발생량의 한계에 도달하므로 측정한계 범위에 들어오지를 못하며, 절대농도 10 mM를 초과시에는 산소가 너무 많이 발생하여 DO값이 포화되어 버린다. 참고로 상온에서의 산소의 용해도는 20 mg/l이다.

Fig. 1과 Fig. 2에 동적 응답결과와 측정가능 범위를 나타내었는데, 알콜의 양이 많으면 반응속도가 떨어지며, 이러한 사실은 앞서 예측한 반응경로 및 알콜 측정 방법이 맞음을 보여준다. 두가지 알콜류와 과산화수소에 대하여 각각 반응속도론적 분석을 시도한 결과 과산화수소농도가 낮은 영역에서는 Lineweaver-Burk 도식에서 비교적 선형적인 결과를 얻을 수 있었다. 이는 과산화수소의 양이 너무 많으면 기질 저해 작용이 있으며, 메탄올, 에탄올의 농도가 너무 높으면 반응속도 저하와 기울기도 변화하는 등 심한 저해 작용이 있음을 알 수 있었다. 그러나, 본 연구에 도입된 바와 같이 agarose bead에 고정화된 catalase를 사용한 경우는 methanol에 대하여도 센서로서의 응용 가능함을 알 수 있었다. 메탄올의 경우 에탄올보다 효소에의 활성이 보다 심하였으나, 고정화된 catalase를 이용한 경우는 활성저하가 일어나지 않았으며, 1.25와 2.5 mM의 과산화수소가 공급되었을 경우 최대 50 mM 정도까지 메탄올 농도를 측정 가능하였다. 응답시간은 메탄올의 농도에 따라 길어지며, 정상상태에 이르렀을 때의 DO값도 메탄올의 농도에 따라 선형적으로 증가하였다. 따라서 최적의 과산화수소 공급농도가 존재함을 알 수 있었으며, 이 농도 범위대에서 대략적으로 20-60초 이내에 센서가 응답하는 것을 확인할 수 있었다.  이로서 본 연구를 통하여 catalase는 에탄올 뿐만 아니라 메탄올 센서의 제작에도 사용될 수 있음을 확인할 수 있었으며, 제작된 메탄올 센서의 경우 바이오센서로는 처음으로 그 제작가능성이 검토되었다.

참고문헌

1. 주 현, 김용환, 변석훈, 유영제, 화학공학, 34, 77-82, 1996.

2. Lardinois, O. M. et al., Biochim. Biophys. Acta, 1295, 222-227, 1996.

3. Joo, H., Yoo, Y. J., and Ryu, D. D. Y., Enzyme Microb. Technol., 19, 50-56, 1996.

4. Walsh, C., "Enzymatic Reaction Mechanisms", pp 493-494, Freeman and Company, San Francisco, 1979.

Fig. 1 Required time to reach the steady-state values

(---; 95 % confidence level, ●; experimentals)

Fig. 2  Linearity of methanol concentration with output signal

of dissolved oxygen concentration.

(■; 2.25 mM H2O2, ●; 1.25 mM H2O2)