제조용 액체 크로마토그래피에서 Column 크기와 HETP의 상관관계

이종호, 최두찬, 노경호

인하대학교, 화학공학과

Correlation of Column Dimension and HETP

in Preparative Liquid Chromatography

Chong Ho Lee, Du Chan Choi, Kyung Ho Row

Dept. of Chem. Eng., Inha University

서론

크로마토그래피에서의 분리는 물질간의 체류시간의 차이에 의해서 결정된다.  Column 효율은 이동상의 유속, 입자 크기, column 크기의 함수이고 피크의 폭에 의해서 결정된다.  피크간의 분리는 이동상과 고정상간의 특성인 column 선택도의 함수로 나타내어진다.  체류시간은 관내의 이동상과 고정상의 부피, 물질과 고정상의 용량인자에 의해 결정된다 [1].  이론단수의 개념은 증류 이론으로부터 발전되어 왔으며 크로마토그래피 공정에서도 이러한 개념을 적용할 수 있고, column 효율을 측정할 수 있는 중요한 수단이 된다.  기본적으로 column 효율은 체류시간과 피크의 폭간의 비교이다.  Column이 효율적이면 피크의 폭은 작아지며 이론단수는 column 길이에 비례한다.  서로 다른 조건의 column이라고 할지라도 column의 척도로서 HETP (Height Equivalent to a Theoretical Plate)를 이용하여 column 효율을 비교 및 예측할 수 있다 [2].

분석용 기기로서 우수한 성능을 갖는 크로마토그래피를 scale-up을 하기에는 많은 operating variables 또는 column 크기에 대해서 최적화할 필요가 있다.  많은 변수에 대해서 HETP의 최적조건을 실험적으로 구하기에는 어려움이 있고 이를 위해서 상관관계식을 이용하는 것이 최근의 경향이다 [3-5].  제조용 크로마토그래피를 이용하여 많은 양의 원료를 분리하기 위해서는 분석용 column에서 사용된 충진물보다 많은 양을 필요로 한다.  이 양을 충진시키기 위한 column의 크기는 원통형으로 D와 L값을 결정해야 한다.  따라서 주입된 시료의 질량과 column의 크기는 제조용 크로마토그래피 공정에서 중요한 의미를 갖게 된다.

본 연구에서는 시료의 주입부피와 시료의 농도, 이동상의 유속, 이동상의 조성 변화 (methanol의 부피양)와 column의 크기 (직경과 길이)가 HETP에 미치는 영향을 고찰하였다.  각각의 실험변수 및 실험변수간 상호작용에 의한 HETP변화를 고려하여 회귀분석에 의하여 linear, quadratic, quadratic 및 interaction term, 자연로그를 포함한 linear, quadratic, quadratic 및 interaction term을 포함하는 6개의 상관관계식을 시도하였고 이 중 regression coefficient가 가장 좋은 식을 이용하여 각 실험변수가 HETP에 미치는 영향을 고찰하였다.

실험

본 실험에 사용된 system은 HPLC metering pump (Model 2396-26, TSP)와 U6K injector (2ml sample loop), 6000psi까지 압력을 조정할 수 있는 back pressure regulator (Tescom co., Model 26-1722), rotameter 등으로 구성되어 있다. 시료의 검출은 254nm의 파장에서 UV variable detector를 PC에 on-line으로 연결하였다. Column은 pore size 120Å, particle size 40∼63□인 octadelcyl silica (YMC co.)로 충진하였다.

실험에 사용한 시료인 thymidine은 Sigma Co.에서 구입하였으며 HPLC- grade의 물에 용해하여 각각 500∼10,000ppm의 용액을 만들어 사용하였다. 이동상은 물을 사용하였고 organic modifier는 메탄올이었으며 이동상의 유속은 3.5∼5.5□/min이었다. 물은 실험실에서 제조한 증류수이며 탈이온화 한후 membrane filter로 여과하였으며 methanol은 Baker Co. (Phillipsburg NJ, USA)에서 구입한 HPLC용매이고 여과하여 사용하였다. 모든 실험은 상온에서 행하였으며 각 실험변수의 범위는 Table 1에 나타내었다.

Table . Experimental variables and ranges

Variables	Range
injection volume	0.1 - 2.0 ml
concentration	0.5 - 10 mg/ml
sample amount	0.1 - 20 mg
flow rate	3.5 - 5.5 ml/min
methanol percentage	1 - 20 (v/v, %)
diameter	4.6 - 9.8 mm
length	100 - 500 mm

결과 및 고찰

실험에서 얻은 peak로부터 HETP는 다음 식에 의해서 측정하였다.

HETP = L/N, N=5.54(tR/w1/2)2

w1/2은 peak의 1/2높이에서 peak의 폭이다. 6개의 실험변수의 관계를 나타내기 위해서 (1) linear equation, (2) quadratic equation, (3) quadratic equation with interaction terms (x1x2, x1x3, x1x4...)과 위의 세가지 식에 대한 자연로그 형태등 총 6개의 식으로 상관하였다. 그 중에서 regression coefficient가 가장 좋은 다음과 같은 quadratic equation with interaction terms based on natural logarithm을 사용하였다.

HETP=19.427+0.645LnX1+0.026(LnX1)2+1.239LnX2+0.035LnX1LnX2-0.0021(LnX2)2+    12.637LnX3+0.099LnX1LnX3+0.071LnX2LnX3-4.116(LnX3)2+19.572LnX4+

0.011LnX1LnX4+0.023LnX2LnX4-0.171LnX3LnX4-3.535(LnX4)2-5.363LnX5-

0.390LnX1LnX5+0.079LnX2LnX5-1.875LnX3LnX5+0.744LnX4LnX5+4.185(LnX5)2-

15.787LnX6+0.043LnX1LnX6-0.237LnX2LnX6+0.854LnX3LnX6- 0.812LnX4LnX6-

2.224LnX5LnX6+1.950(LnX6)2 , Ln = natural logarithm

윗 식에서 X1, X2, X3, X4, X5, X6는 각각 시료의 주입부피, 시료의 농도, 이동상의 유속, 이동상 내에서의 메탄올 volume percentage, column 직경과 column 길이를 나타낸다. 주입양(X1*X2)은 주입부피(X1)와 시료농도(X2)의 곱으로 계산된 값이다.  6가지 실험변수에 대하여 4가지 실험변수를 고정하고 다른 2가지의 실험변수가 HETP에 나타내는 영향을 Fig. 1, Fig. 2, Fig. 3에 나타내었다.

Fig. 1. Response surface of HETP to D and L.

(1mg injected amount, 5.5ml/min flow rate, 5% MeOH)

Fig. 2. Response surface of HETP to L and injected amount.

(7.8mm I.D., 5.5ml/min flow rate, 5% MeOH)

Fig.1은 column 직경과 길이에 따른 HETP의 변화를 3차원 그래프로 나타낸 것으로 직경이 약 10mm에서 HETP가 최소값을 가지며 길이가 감소함에 따라 column 효율이 나빠지게 된다. 주입된 양과 column 길이가 HETP에 미치는 영향을 보면 주입된 양은 HETP에 거의 영향이 없지만 column 길이는 약 150mm에서 최적값을 갖는다 (Figs. 2,3).

Fig. 3. Response surface of HETP to D and injected amount.

(100mm length, 5.5ml/min flow rate, 5% MeOH)

참고문헌

1. Nina Hadden et al., "Basic Liquid Chromatography", Varian Aerograph (1971)

2. Y. Guillaume and C. Guinchard, J. Chrom. Sci., 33, 204 (1995).

3. Yeong Shun Gau, Shao Wen Sun, Russel Rhei-Long Chen,

J. Liq. Chromatogr.,18, 2373 (1995)

4. A. Valiente Barderas, F. Duprat, J. Liq. Chromatogr.,17, 1709 (1994)

5. Y. J. Yao, H. K. Lee, S. F. Li, J. Liq. Chromatogr.,16, 2223 (1993)

알림

본 연구는 1997년도 과학재단 핵심연구지원에 의해서 수행되고 있습니다.