SDS를 이용한 재조합 인 성장호르몬의 재생공정 최적화

김창성,  이은규, 안상점*

한양대학교 화학공학과, (주) 녹십자 생물공정팀*

Optimization of r-hGH Inclusion Body

Renaturation Process Using SDS

Chang-Sung Kim, Eun-Kyu Lee, Sang-Jeom Ahn*

Department of Chemical Engineering, Hanyang University

Korean Green Cross Corp., Bioprocessing Team*

서론

의학용 재조합 단백질의 생산을 위해서 다양한 형태의 숙주세포들이 사용되어지고 있으나, 현재 가장 많이 사용되어지는 것은 E. coli 로서 이는 E. coli 에 대한 생리학, 유전학, 분자생물학적 연구가 가장 잘 확립되어 있고 또한 재조합 기술도 이 균주를 중심으로 이루어져 왔기 때문이다. 원핵세포를 통한 진핵세포 재조합 단백질의 세포내 과발현(overexpre-

ssion)은 inclusion body(내포체)의 형성을 동반한다. 이 같은 내포체는 대개 insoluble form으로 많은 양의 재조합 단백질을 포함하고 있으며 세포질과는 확연히 구분이 되는 부정형의 응집된 형태로 발현된다[1]. 내포체의 형태로 발현된 재조합 단백질을 생물학적 활성을 가진 native protein으로 재생하는 공정은 단백질의 종류에 따라 상이하므로 실험적으로 결정, 개발되어야 한다[2,3]. 인 성장호르몬은 뇌하수체 전엽에서 분비되는 191개의 아미노산으로 구성된 단일 사슬을 이루고 있는 분자량 22k Da의 펩타이드 호르몬으로 세포크기의 증가, 세포 분열의 촉진에 의한 체세포 성장과 연골 성장및 혈당 조절, 지방 분해작용, 단백질의 합성 촉진 및 세포질 내의 전해질 대사 작용 등 직접 세포 대사에 관여하는 것으로 알려져 있다. 본 실험에서는 E. coli 내에 내포체의 형태로 발현된 재조합 인 성장호르몬(r-hGH)을 대상으로 기존의 재접힘(refolding) 공정을 도입하여, 내포체의 용해에 사용되는 용해제의 성능 비교와 최적의 pH, 농도를 분석해 보았고, correct folding을 얻기 위한 효과적인 용해제의 제거 공정과 공정 평가를 하였다. 또한 재접힘 공정의 주요 변수인 단백질의 농도와 이온 강도의 영향을 분석하였고 재접힘 첨가제로 PEG(polyethylene glycol) 및 Tween의 효과도 알아보았다.

재료 및 방법

정제된 r-hGH 및 r-hGH가 발현된 E. coli 세포는 (주) 녹십자에서 제공받았다.  r-hGH의 분자량은 22kD (아미노산 잔기수는 191개)이며, Cys-53와 Cys-165, Cys-182와 Cys-189사이에 disulfide 결합을 이루고 있으며 소수성이 높고 따라서 쉽게 응집체를 형성한다.[4] 실험에 사용된 r-hGH는 fusion monomer의 형태로 발현된 것을 사용하였다. 분석에는 역상 고압 액체 크로마토그래피(Reverse-Phase High Pressure Liquid Chromatography)를 사용하였다. HPLC system은 Gilson 제품 (Model 302, 303, 802c, 811 system)을 사용하였고, 역상 칼럼으로는 Alltech사의 Macrosphere 300 C18 (5 micron 150mm * 4.6mm)을 사용하였고, buffer A로는 0.1% TFA(v/v) in DI H2O , buffer B로는 0.1% TFA(v/v) in acetonitrile를 사용하였으며, 용매의 유속은 1 ml/min, 온도는 25℃로 조절하였으며, UV Detector를 이용 220nm에서 실험을 실시하였다.

내포체의 용해

내포체의 변성, 용해에는 문헌 조사를 통해 일반적으로 사용되고 있는 urea, Gu-HCl, SDS를 사용하여 각각의 성능을 비교, 분석하였다. 실험은 먼저 r-hGH가 발현된 세포를 초음파 분쇄기를 이용하여 파쇄한 후, 세포 파쇄액을 원심하여 pellet을 얻는다. Pellet에 20배 부피의 용해액을 가하여 실온에서 10시간 교반한다. 이 때 가하는 용해액은 buffer I( 0.5% SDS, 21mM Na2CO3, 25mM NaHCO3), buffer II( 8M urea, 21mM NA2CO3, 25mM NaH-

CO3), buffer III( 6M Gu-HCl, 21mM Na2CO3, 25mM NaHCO3)로 하였으며, 각 경우에 있어 RP-HPLC 분석을 통한 농도 대 peak 면적 곡선을 이용하여 단백질의 농도를 결정하였다.(Fig.1)

재접힘공정

내포체 용해액을 24시간 공기산화 시킨 후 재접힘 공정으로는 투석 및 음이온 수지를 이용한 희석 및 용해제 제거 방법을 사용하였다. Urea 및 Gu-HCl의 제거는 MWCO 10,000의 멤브레인을 사용하였고, SDS의 제거는 Amberlite IRA-420을 사용하여 수행하였으며, SDS 제거 효율 및 제거 후의 농도는 1% acridine orange solution을 이용, 499nm에서의 흡광도를 측정하여 SDS농도 대 흡광도 표준곡선을 작성후 시료의 흡광도를 측정하여 결정하였다.

또한 재접힘 공정중 단백질의 초기 농도, 이온강도 및 재접힘 보조 첨가제(PEG, Tween)의 첨가에 따른 영향을 살펴보았다.

결과 및 고찰

정제된 인 성장 호르몬과 실험에 사용된 fusion monomer 발현 인 성장 호르몬은 역상 크로마토그래피(RP-HPLC) 분석에서 동일한 retention time을 가지는 것을 확인하였다. 내포체의 용해성능 평가를 위해 수집된 내포체를 3가지의 용해액(0.5% SDS, 8M urea, 6M Gu-HCl)으로 용해 후, 탄산 완충액으로 diafiltration 시켜 용해제를 제거함으로써 이황화 결합의 재생을 통한 재접힘 공정을 수행한 후 용해액의 내포체 용해 및 재생성능을 평가하였다. 그 결과 0.5% SDS의 경우 용해후 재생 수율이 91%, 8M urea의 경우 16%, 6M Gu-HCl의 경우 64%로서 SDS가 가장 우수한 용해제로 판명되었다.(Fig. 2) 또한 이 결과를 바탕으로 SDS의 농도(0.1%, 0.2%, 0.5%, 1.0%, 2.0%)와 pH(5, 7, 9.5, 12)의 영향을 분석한 결과 0.5%, pH 9.5일 때 가장 좋은 효과를 나타냄을 알 수 있었다.(Fig. 3) 인 성장 호르몬의 PI는 약 6.7이므로 알칼리 환경에서 재접힘공정을 행하는 것이 효과적이라는 기존의 발표를 확인할 수 있었다. 재접힘 공정은 일반적으로 변성제의 농도를 급격히 감소시켜 수행하며 공정 중 단백질의 초기 농도는 0.2mg/ml 이하에서 수행하는 것이 바람직하다고 알려져 있다. 이것은 단백질 분자간의 상호작용을 최대한 방지함으로서 정확한 재접힘을 촉진하고 응집체의 형성을 방지하려는 목적에 의한 것이다. 본 실험에서는 다양한 초기 농도(0.1, 0.2, 0.5, 1, 2, 5mg/ml)에서 재접힘 공정을 수행한 결과 1mg/ml 이하의 농도에서 비교적 높은 수율을 나타내었으며, 그 이상의 농도에서의 재접힘 공정의 수행은 응집체의 형성으로 인해 바람직하지 않은 것으로 확인되었다.(Fig.4) 재접힘 첨가제로서 PEG4,000을  투여함으로서 재접힘 공정수율을 향상시킬 수 있음을 확인하였고 Tween을 첨가 한 결과 응집체의 형성을 방지하고 단백질의 변성을 막아 재생 수율을 높일 수 있는 것을 확인하였다.(Fig.5) 이것은 PEG와 Tween은 nonionic cosolvent로서 재접힘 공정 중 1차 중간체와 작용하여 구조적 안정성을 부여하고 소수성결합에 의한 응집을 막아주어 결과적으로 재접힘 공정의 최종 수율을 향상시키는 것으로 생각되어 진다.[5,6] 또한 이온 강도의 영향을 분석한 결과 내포체의 용해에는 낮은 것이(□10mM), 재접힘공정에서는 응집체 형성을 최소화하기 위해 높은 것이(>50mM) 유용한 것으로 확인되었다. 또한 실험의 결과로 PEG는 내포체 용해성능의 향상에 Tween은 응집체 형성 억제에 더욱 좋은 효과를 보이는 것을 확인하였다.(Fig. 6) Amberlite IRA 420을 이용한 SDS제거에서는 3g SDS/ l IRA 420의 SDS 흡착효능을 보였으며 용해제 제거 후  refolding 전환율은 약 70% 였다. 결과를 바탕으로 내포체의 형태로 발현된 r-hGH의 회수 공정에서 SDS를 이용 내포체를 용해하는 것이 효과적이며, IRA 420을 이용한 SDS의 제거공정 수립과 재접힘 공정에 작용하는 다양한 공정 변수의 영향을 평가함으로서 보다 경제적이고 효율적인 인 성장호르몬의 회수공정이 가능하리라 판단된다.

참고문헌

1.Schoner, E. G., Ellis, L. F. and Schiner, B. E. (1985) Bio/Technology, 3, 151-154

2.Rehm, H. -J. and Reed, G. (1993) Biotechnology, 3, 535-544

3.Gribskov, M. and Burgess, R. R. (1983) Gene, 26, 109-118

4.Rajender. K., Chawla. John. S., Parks and Daniel Rudman(1983), Ann. Rev.

Med., 34, 519-547

5.Jeffrey L. Cleland and Daniel I. C. Wang(1990), Biotechnology. 8, 1274-1278

6.Narendra B. Bam, Jeffrey L. Cleland and Theodore W. Randolph(1996),        Biotechnol. Prog. 12, 801-809