굴껍질내에서 Calcite 형성과 관련된 결정내부단백질에 관한 연구

윤승열, 김용완, 최청송

서강대학교 화학공학과

A Study of Intracrystalline Proteins Binding to Calcite in Oyster Shell

Seung-Yul Yun, Yong-Wan Kim, Cheong-Song Choi

Dept. of chemical Engineering, Sogang University

1.서론

Biomineralization을 통해 형성된 패각 결정체조직의 단백질함유는 0.5□/□ of calcite이며 이러한 미량은 결정의 핵생성과 성장을 제어하고 각 객체 고유의 morphology와 강도에 영향을 준다고 알려졌다.[1]  또한 최근에는 AFM으로 패각의 calcite결정에 결합되어있는 굴껍질 단백질의 선택적 배열이 확인되었으며 molecular modeling으로 상관관계를 분석하였고 일본에서는 조개껍질조직의  DNA배열을 분석, 시험관 진주 개발에 성공하였다.  이러한 연구에서 단백질은 패각형성의 가장 초기 단계에서 껍질을 형성하는 결정사이에  삽입되는 것으로 알려졌다.[2]   또한 합성 calcite는 잘 발달된 {104}면으로의 쪼개짐특성을 보이나 패각은 무정형의 균열을 보인다.  결정내부단백질(intracrystalline proteins)은 결정 쪼개짐의 진행과 관련, calcite 결정고유의 쪼개짐특성인 {104}진행방향을 방해한다.   따라서 이러한 단백질은 결정격자내 불연속점을 형성하게 되고 결정화도를 감소시킨다.   즉 삽입된 단백질들이 결정조직에 영향을 미친다.

특정 고분자를 선택적으로 합성결정내부에 흡착시켜 삽입한 단결정 복합물질 제조 및 결정의 기계적 성질에 영향을 미치는 방식에 대한 연구는 재료공학에 폭넓게 응용될 수 있다.[3]  또한 거대분자군(macromolecules)에 의한 패각의 결정성장메카니즘은 제대로 이해되고 있지 않지만 특정 결정면에 대해서는 calcium carbonate와 단백질의 선택적 상호작용으로 결정성장이 억제되거나 조장되기도 한다.  이러한 해석은 간단한 유기분자나 패각류에서 추출한 단백질의 혼합물을 이용한 실험에서 밝혀졌다. 이와같은 연구에서는 합성calcite의 hexagonal crystallographic symmetry를 볼 수 없었다.  이것은 어떻게 생물학적 환경이 고유의 결정학적 symmetry를 극복할 수 있는가라는 흥미를 일으킨다.

따라서 위와같은 연구를 입증하기 위해 더욱 분리정제되고 균질화된 단백질 조성에 대한 연구 필요성이 제기된다.  단백질은 FPLC를 이용하여 분리정제된다.  분리된 단백질은 가수분해를 통해 단백질내 존재하는 아미노산고리에 대한 정보를 얻을 수 있다.

본실험에서는 폐패각을 이용하여 투석과 FPLC를 이용, 패각결정내 단백질을  분리정제하였고 아미노산분석을 통해 결정내부단백질의 실체를 분석하였다.   이러한 접근으로부터 좀 더 정확한 미세화학적 환경, 미세구조변화및 calcite상변환에 미치는 인자들에 대한 명확한 이해를 얻을 수 있을 것이다.

2.실험

깨끗이 세척하고 건조한 굴껍질을 6% KOH 용액에 4-8시간 함침 시키거나 5% NaOH 용액에 5-10시간 동안 담근후 세척하여 굴껍질 표면의 이 물질을 제거하였다.  이 건조된 껍질을 분쇄한 것과 박층분리를 통해 세층으로 분리한 것을 시료로 준비하고, 이를 2% acetic acid로 투석(SIGMA dialysis tubing)하여 decalcification하고 NaOH를 이용하여 pH 8.0을 맞춘다.  투석막 안의 내용물을 2차증류수를 이용하여 2일 동안 재투석하고 원심분리기(10000 g, 10 min)를 이용하여 soluble matrix(SM)와 insoluble matrix(IM)로 분리하고 SM을 동결건조(Labconco Freeze dryer)한 후 보관한다.  또한 0.5M EDTA와 HCl을 이용하여 acetic acid와 같은 방법으로 SM을 얻어낸다.

동결건조된 SM의 일부를 20mM Tris base(Tris(hydroxymethyl)aminometha

-ne) buffer 용액(pH 8.0)에 녹인 후, Superdex 200 column(Pharmacia, HR 10/30)과 anion-exchange Mono Q column(Pharmacia, HR 5/5)을 사용한 FPLC(Pharmacia LKB/FPLC system, 214 nm detector)를 이용하여 protein을 분취하였다.  이때 1M NaCl linear gradient를 주었다.  각각 분취된 fraction들은 2차증류수로 투석하고 동결건조하여 아미노산 조성분석(Waters / HPLC PICO.TAG system)을 하였으며, 정제상태와 분자량을 전기영동으로 확인하였다. 또한 동결건조로 얻어진 단백질 분말을 FTIR(Midac/386)을 이용하여 분석하였다.

3.결과 및 고찰

굴껍질내에 함유되어 있는 단백질을 추출해내기 위해서 HCl과 2% acetic acid를 사용한 투석막을 이용하여 mineral을 decalcification하였다.  투석막의 이용은 낮은 분자량을 갖는 조성과 decalcification과정에서 생성되는 이온을 제거하는데 용이하다.  HCl을 이용한 추출은 비교적 짧은 시간내에 완벽한 dissolution이 가능하고 추출한 단백질의 양도 acetic acid에 비해 많지만(Table 1.) 낮은 pH 조건에서 실험이 이루어지기 때문에 단백질의 변성이나 손실의 가능성이 높다.  반면에 acetic acid에 의한 단백질 추출은 dissolution 시간이 길지만 산에 의한 단백질 손상이 비교적 적다.  또한 Table 1.에서 보듯이 패각내 단백질에대한 아미노산 조성면에서, 이 두가지 추출법에 의한 조성을 보면 모두 일반적인 biomineralization에의해 형성된 패각결정에서 나타나는 높은 함량의 aspartic acid를 갖는다.

Fig 1.은 acetic acid로 추출한 soluble matrix(SM)를 FPLC를 이용하여 gel filtration(280 nm)한 결과를 보여주고 있다. retention time이 30min부근에서 peak를 보이는 것으로 보아 이 단백질의 분자량이 대략 160kD임을 예측할 수 있다.  또한 peak가 한 곳에서 뭉쳐서 나타나는데, 이는 저분자량의 단백질들이 투석막(120kD cutoff)을 통해 빠져 나간 결과라고 볼 수 있다. 이로써 SM은 비슷한 분자량을 갖는 적은 수의 단백질로 이루어져 있음을 알 수 있다.  이 단백질들을 분리하기위하여 anion-exchange Mono Q column을 사용하였다.(Fig 2.) Fig 2.에서 보듯이 3개의 peak로 단백질 분리가 이루어졌고, fraction 1-3, fraction 9-10, fraction 14-18, fraction 19-25의 네 개로 나누어 아미노산 조성 분석을 수행하였을 때 관심의 대상이 되는 aspartic acid 함량에서 차이를 보였다.

또한 결정내 단백질의 특성을 FTIR을 이용하여 살펴보았다.(Fig 3.)  Table 2.는 주요 흡수대와 그들의 assignment를 나타내었다.  가장 큰 intensity를 갖는 것은 amide I(C=O) band로 polypeptide chain의 conformation에 의존하는 1648 cm-1 이다. 또한 다당류인 polysaccharide의 흡수영역은 1050-1150 cm-1 이다.(Table 2.)  이 흡수 영역에서 peak intensity가 amide I 흡수대에 비해 낮은 것으로 보아 굴껍질에서 추출한 macromolecule에는 상대적으로 적은 비율로 polysaccharide가 존재함을 알 수 있다.

또한 Morphology 특성에 따라 세층으로 분리된 시료들에 대한 단백질 특성을 알아보고 각층 형성을 위해 어떻게 기여하는지를 살펴볼 수 있다.

참고문헌

1.mann S, Nature, 332, 119 (1988)

2.DoSuk Duke LEE, J. Cryst. Growth., 102, 262 (1990)

3.Amir Bermann, Science, 250, 664 (1990)

Table 1. Amino acid compositions of Soluble Macromolecules

extracted from within Oyster shell using Acetic acid & HCl

	HCl	Acetic acid
protein	0.23	0.12
Asx	49.5	21.37
Thr	2.2	2.21
Ser	3.6	7.13
Glx	25.8	5.22
Pro	0.2	5.61
Gly	3.6	40.54
Ala	8.3	3.48
Val	1.9	2.09
Met	0.3	2.46
Ile	0.5	1.05
Leu	1.1	1.27
Tyr	0.6	3.12
Phe	0.5	0.68
Lys	1.0	2.48
His	0.2	0.0
Arg	0.7	1.31

Table 2. Position of the main infrared absorption bands of Oyster(cm-1)

	COOH	Amide I	COO- asymmetric	Amide II	COO- symmetric	Sugar groups
Oyster	1737	1634	1600	1545	1420	1050-1150