PHB의 화학적 분해에 의한 광학적으로 순수한 (D)-□-hydroxybutyric acid와 그의 메틸, 에틸 에스터의 생산

이영, 이상엽

한국과학기술원 화학공학과 및 생물공정연구센터

Production of Optically pure (D)-□-hydroxybutyric acid and it's Methyl-, Ethyl- Esters by chemical depolymerization of PHB

Young Lee, Sang Yup Lee

Department of Chemical Engineering and BioProcess Engineering Research Center, Korea Advanced Institute of Science and Technology

서론

생체 내에서 일어나는 반응들은 대부분 효소의 촉매작용에 의해 진행된다. 이러한 반응에서 효소와의 결합특성으로 인해 기질의 입체 특이성(stereospecipicity)이 중요한 역할을 하며, 광학활성(chirality)를 가지고 있는 기질만이 반응하게 된다. 즉, 2종의 enantiomer 중 한쪽만이 생리활성이 있게 된다. 생체반응시 다른 쪽 enantiomer의 존재는 단순한 희석효과만이 아니라 때때로 이로 인한 부작용을 초래하기도 하며, 이에 따라 생체반응과 관련이 있는 정밀화학제품이나 의약품의 전구체로서의 키랄성 분자의 생산기술이 절실히 요구되고 있는 실정이다.

현재 일본에서는 라세믹체(racemic mixture) 형태의 의약품은 제조승인 신청이 사실상 불가능하게 된 상황이다. 따라서, 특히 의약품의 제조의 경우 키랄성 분자만을 생산하고자 하는 연구가 많이 이루어지고 있다. 현재 키랄성 화합물의 생산방법으로는 chiral pool을 이용하는 방법과 라세믹체로부터 분리하는 방법, 비대칭 합성(asymmetric synthesis)을 이용하는 방법 등이 사용되고 있으며, 대개의 경우 생산단가를 높이게 되는 주된 원인이 되고 있어, 경제적인 키랄성 화합물의 생산방법의 개발이 요구되고 있는 실정이다.

(D)-□-hydroxycarboxylic acid는 하이드록실 기와 카르복실 기의 두개의 기능기를 동시에 가지고 있으며 기능기 전환이 편리하고, chiral induction에 의한 간편한 새로운 키랄 중심(chiral center)의 도입이 가능한 점 등의 장점을 가지고 있어 키랄성 전구체로 널리 이용될 수 있다. 현재 발효공정에 의한 aliphatic glycol의 산화 반응, 미생물에 의한 carboxylic acid의 (D)-□-hydroxyl화 반응, □-diketone의 키랄촉매에 의한 수소화 반응 등에 의해 주로 생산되고 있다. 항생제, 비타민, 향료 및 pheromone 등의 합성을 위한 전구체와 의약품 디자인에 사용되는 비펩타이드 리건드(ligand) 개발을 위한 응용, 신규 의약품 개발을 위한 전구체 등의 폭넓은 응용이 기대되고 있는 (D)-□-hydroxycarboxylic acid는 특히 페니실린을 대체할 락탐계 항생물질로 주목을 받고 있는 카바페넴계 항생물질(carbapenems)들의 전구체로서 사용될 수 있으며, methyl (D)-□-hydroxybutyrate로부터 (+)-thiennamycin을 합성하는 방법이 보고되었다.

최근 (D)-□-hydroxybutyric acid를 단량체로 갖는 PHB의 경제적인 대량생산기술의 개발에 따라 이를 분해함으로써 광학활성을 갖는 (D)-□-hydroxybutyric acid 및 이의 알킬 에스터들의 경제적 생산이 가능해지게 되었다. 따라서 본 연구에서는 재조합 대장균을 이용하여 고농도로 생산된 PHB로부터 산 촉매를 이용한 화학적 분해에 의한 (D)-□-hydroxybutyric acid 및 이의 메틸, 에틸 에스터의 효율적인 생산 가능성을 타진하였다.

실험

유가식 배양에 의한 PHB 생산. 생산 균주로는 Alcaligenes eutrophus의 PHA 생합성 유전자를 클로닝한 재조합 대장균 XL1-Blue (pSYL107)를 사용하였다. 배지로는 modified R 배지를 사용하였으며 pH-stat 기질 공급법을 이용하였다. 48시간 배양으로 최종 균체농도는 204 g/L, PHB 농도 157 g/L를 얻었으며 PHB 함유율은 77%, 생산성은 3.3 g/L-h였다.

PHB 분리·정제. 생산된 PHB의 분리는 simple digestion method를 사용하였다. 사용한 digestion 화합물은 계면활성제인 sodium dodecylsulfate (SDS), 염기인 KOH, NaOH를 사용하였고, SDS는 5%, KOH와 NaOH는 0.2N의 농도로 사용하였다. 50 g의 균체를 1 L의 digestion 화합물에 분산시킨 후 37℃에 1시간 방치한 후 2,500×g로 20분간 원심분리하여 침강물을 증류수로 2회 세척후 건조하였다. Simple digestion method에 의해 분리된 PHB의 순도는 사용한 digestion 화합물이 5% SDS일 때 99%, 0.2N KOH일 때 92%, 0.2N NaOH일 때 96%였고, 수율은 각각의 경우 89%, 90%, 91%에 달하였다.

분석. 생성된 (D)-□-hydroxybutyric acid의 농도는 HPLC로 측정하였고, 알킬 에스터 농도는 GC로 methylation한 benzoic acid를 internal standard로 사용하여 측정하였다. 생성된 물질은 CDCl3에 녹여 proton NMR로 구조를 확인하였다.

분리법 및 산 촉매 종류에 따른 PHB 분해도 비교. 분리법 및 산 촉매 종류가 PHB 분해에 미치는 영향을 확인하기 위해 3종의 digestion 화합물을 이용한 simple digestion method를 이용해 분리한 PHB를 황산과 염산의 두 종류의 산 촉매로 메탄올과 함께 반응하여 반응시간에 따른 methyl (D)-□-hydroxybutyrate의 생산을 측정하였다. 각 10 mg의 정제된 PHB를 tube에 넣고 2 ml의 반응용매인 클로로포름과 2 ml의 메탄올, 100 □l의 산 촉매를 첨가한 후 80℃ water bath에서 반응하였다.

산 분해에 의한 (D)-□-hydroxybutyric acid의 생산. PHB의 산 분해에 의해 단량체인 (D)-□-hydroxybutyric acid를 생산하였다. 산 촉매로는 p-toluenesulfonic acid를 사용하였고, SDS로 분리한 PHB를 사용하였다. 50 g의 PHB를 200 ml의 반응용매인 1,2-dichloroethane과 함께 환류 존재하에 150℃ oil bath에서 1시간 혼합한 후 2.5 g의 산 촉매를 첨가하여 30분간 추가가열하였다. 11.8 ml의 메탄올을 응축기를 통해 첨가한 후, 140℃에서 환류 존재하에 48시간 반응하여 methyl (D)-□-hydroxybutyrate를 생성하였다. 메틸기를 제거하기 위해 60 ml의 증류수를 첨가하여 130℃에서 4시간 가수분해한 후 180℃로 온도를 변경하고 4시간에 걸쳐 총 270 ml의 증류수를 나누어 첨가하며 200 ml의 용매 혼합액(1,2-dichloroethane /methanol/water 혼합액)을 distillation unit을 이용하여 제거하였다. 15시간 동안 추가 가열후 실온까지 냉각하고 ether로 추출하여 감압 건조하였다.

Alkyl (D)-□-hydroxybutyrate의 생산. Alkyl (D)-□-hydroxybutyrate는 10 g의 SDS로 분리한 PHB를 황산을 촉매로 사용하여 분해·생산하였다. PHB와 반응용매인 1,2-dichloroethane, 산 촉매와 알코올을 함께 섞어 환류 존재 하에 끓여 반응시킨 후 ether로 추출하여 감압 건조하였다. 각각의 알킬 에스터의 생산을 위한 반응조건을 표 1에 정리하였다.

결과 및 토론

분리법 및 산 촉매 종류에 따른 PHB 분해도 비교. PHB의 분리를 위한 digestion 화합물의 종류 및 분해를 위한 산 촉매 종류에 대해 시간에 따른 methyl (D)-□-hydroxybutyrate의 생산량을 표 2에 정리하였다. 생산된 methyl ester의 양으로부터 알 수 있듯이 PHB 산 분해를 위한 가장 적합한 분리법은 0.2 N NaOH에 의한 simple digestion method이며, 산 촉매로는 염산을 사용하는 것이 가장 효율적이다. 0.2N NaOH에 의한 분리시 PHB 순도가 96%임을 감안할 때, 4시간 반응시 수율은 약 76%에 달한다. 산 촉매로 황산을 사용할 때 염산을 사용한 경우에 비해 상대적으로 상당히 적은 분해능을 보이는데 이의 주된 원인은 동 부피로 산 촉매를 첨가함에 따라 실제 촉매의 몰 수의 차이로 인한 것으로 사료된다. 그러나 역시 경제성 면에서 볼 때 염산을 사용하는 것이 바람직할 것으로 사료된다. PHB 분리시 5% SDS를 사용한 경우 더 높은 순도를 보였으나 실제 분해가 느린 것은 SDS 분리시의 오염물질이 산 촉매에 의한 분해를 더 크게 방해함을 뜻하며 이는 SDS가 상대적으로 더 높은 원가를 가짐을 생각할 때 매우 고무적인 결과인 것으로 사료된다. 물론 클로로포름에 의한 추출법으로 PHB를 정제할 경우 더 높은 순도의 PHB를 얻을 수 있으나, 역시 비싼 용매 가격으로 인해 경제적인 생산을 위해서는 적합하지 않은 분리법이다.

표 . Alkyl (D)-□-hydroxybutyrate 생산을 위한 산 분해 반응 조건

알킬기	알코올	반응용매 (ml)	산촉매/알코올 혼합용액 (ml)	산촉매 (ml)	반응시간 (h)
메틸-	메탄올	50	50	1.5	25
에틸-	에탄올	72	72	2.2	37

표 . 분리법 및 산 촉매종류에 대해 생산된 methyl (D)-□-hydroxybutyrate (mg/L)

분리용매		5% SDS		0.2N KOH		0.2N NaOH
산 촉매		황산	염산	황산	염산	황산	염산
생산량	1 h	1.29	1.65	1.05	2.20	0.99	2.96
	2 h	1.34	3.77	1.06	3.75	1.18	9.75
	4 h	1.38	4.49	1.65	9.28	2.22	10.03

산 분해에 의한 (D)-□-hydroxybutyric acid의 생산. SDS로 분리한 PHB로부터 그의 단량체를 생산하는 실험에서 50 g PHB로부터 약 27.5 g의 단량체를 얻었으며 수율은 약 45%에 달하였다. 이와 같이 상대적으로 낮은 수율이 얻어진 이유는 앞서 살펴본 분리법에 따른 분해효과와 연결시켜볼 때 SDS의 오염으로 인한 분해능 저하가 그 원인 중 하나인 것으로 사료된다. 또한 (D)-□-hydroxybutyric acid의 생산 공정이 메틸 에스터의 생산 후 다시 메틸기를 제거하는 사실상 2단계로 이루어져 있기 때문에 수율이 더욱 낮아지며, 물질 자체의 불안정성으로 인한 repolymerization 효과도 있는 것으로 사료된다. 생산된 물질의 HPLC 분석시 여러 크기의 올리고머들의 peak가 관측되었으며 이러한 결과는 repolymerization의 가능성을 뒷받침한다. 이러한 올리고머들로부터 단량체의 분리는 감압증류에 의해 수행할 수 있으나, 단량체의 불안정성으로 인해 30℃ 이하의 낮은 온도에서 수행해야 함에 따라 압력을 매우 낮게 하여야 함으로 실제 공정에는 적합하지 않다. 생산된 단량체의 구조를 확인하기 위해 소량을 정제하여 proton NMR로 분석하였으며 그 데이터로부터 생성된 물질이 (D)-□-hydroxybutyric acid임을 확인할 수 있었다. NMR data를 그림 1에 나타내었다.

그림 . (D)-□-hydroxybutyric acid의 proton NMR Data

Alkyl (D)-□-hydroxybutyrate의 생산. 메틸, 에틸 에스터의 생산량은 각각 9.3 g, 10.7 g으로 모두 약 65% 정도의 수율을 보였다. 역시 NMR 결과로부터 원하는 물질이 생성되었음을 확인할 수 있었다. 앞서 살펴본 (D)-□-hydroxybutyric acid의 경우와는 달리 올리고머의 존재는 검출되지 않았으며 수율이 낮은 원인은 ether 추출시 손실로 인한 것으로 사료된다. 이는 효율적인 분리·정제법의 개발로 해결될 것으로 기대된다.

PHB의 산 분해로 단량체인 (D)-□-hydroxybutyric acid와 그의 메틸, 에틸 에스터의 생산 가능성을 타진하였다. 배양한 균체로부터 PHB의 회수는 0.2N NaOH를 사용함으로써 효율적으로 수행할 수 있으며, 산 분해시 염산을 사용하면 효율적인 생산이 가능함을 알 수 있었다. SDS를 이용해 회수한 PHB로부터의 산 분해 실험을 통해 (D)-□-hydroxybutyric acid와 그의 메틸, 에틸 에스터의 생산이 가능함을 확인하였으며, 물질의 불안정성으로 인해 (D)-□-hydroxybutyric acid의 생산은 그다지 좋은 방법이 아님을 알 수 있었다. 또한 (+)-thiennamycin의 합성을 위한 전구체로서도 메틸 에스터가 사용되므로 안정한 alkyl ester의 형태로 생산하는 것이 더 효율적이다. 생산물의 분리단계에서 수율의 감소가 주로 일어나며, 기존에 제안된 감압증류로 정제시 생산단가의 상승효과가 생기므로 보다 효율적이고 경제적인 분리·정제법의 개발이 필요하다.

감사

본 연구는 통상산업부 지원 공업기반기술사업 중기거점기술개발사업으로 수행되었으며 지원에 감사드립니다.

참고문헌

1. Chiba, T. and Nakai, T., Chem. Lett., 651(1985)

2. Choi, J.-I. and Lee, S.Y., Bioprocess Eng., in press, 1997

3. Noyori, R., Ohkuma, T.,  Kitamura, M., Takaya, H., Sayo, N., Kumobayashi, H., and Akutagawa, S., J. Am. Chem. Soc., 109, 5856(1987)

4. Hahn, S.K., Chang, Y.K. and Lee, S.Y., Appl. Environ. Microbiol., 61, 34(1995)