반응매질에 용해된 리파제를 이용한

유기용매 내에서의 에스터화 반응에 관한 연구

이 홍순, 이 선복

포항공과대학교 화학공학과*

A Study on the Esterification Reactions

in Organic Media Using Organic Solvent-soluble Lipases

Hong Soon Rhee and Sun Bok Lee

Department of Chemical Engineering,

Pohang University of Science and Technology

서  론

효소를 촉매로 하는 반응은 화학적 반응에 비해 온화한 조건에서 특정 반응만을 유도할 수 있는 잇점이 있다1.  전통적으로 효소 반응은 주로 생체내의 환경과 비슷한 수용액에서 이루어졌으나, 최근 물이 거의 없는 유기용매내에서도 효소의 활성(catalytic activity)이 있는 것이 발견되면서 다양한 응용가능성을 제공해 주고 있다2.	유기용매 내에서의 효소 반응은 수용액에서 얻을 수 없는 많은 장점들을 가지고 있어 최근 활발히 연구되고 있는 분야이다.  유기용매 내에서 효소 반응을 수행할 경우 반응 속도에 영향을 미치는 인자로는 반응혼합물에 포함된 수분의 양3, 반응의 매질로 쓰이는 유기용매4, 그리고 담체 및 첨가제의 영향5 등을 들 수 있다.  특히 수분의 양은 중요한 인자로서 효소활성을 위해서는 수분이 필수적이다.  그러나 필수적인 미량의 수분이 유기용매내에 현탁된 효소 입자들을 서로 엉겨붙게 만드는 효소응집(enzyme aggregation)을 유도한다는 사실이 여러 논문에서 보고되고 있다6,7. 효소응집은 유기용매 내에서의 효소 반응에서 소량의 수분에 의해 쉽게 일어날 수 있으며, 효소 입자의 표면적을 감소시켜 반응 속도를 떨어뜨리게 된다. 본 연구 그룹에서는 효소 고정화를 시키지 않고, 단순히 고정화에 쓰이는 담체를 반응매질에 첨가함으로써 이를 어느 정도 막을 수 있다는 것을 발견하였다8.  고체 담체인 실리카겔을 첨가한 경우 유기용매 내에서의 효소반응속도가 현저히 개선되었는데,  그 이유는 첨가된 담체가 효소가 유기용매내에서 수분에 의해 응집되는 응집체(aggregates)의 크기를 감소시켜 효소입자들을 효과적으로 분산시켰기 때문이다.  유기용매내에서 반응속도를 감소시키는 효소응집을 막는 방법으로 담체를 첨가하는 것 외에 효소를 반응매질에 용해되는 형태로 modification하는 방법이 있다.

표면에 긴 사슬의 지방산이 포함된 지질을 코팅시킨 효소를 사용하거  나9-11 역마이셀 시스템에 적용된 효소를 사용하면12, 유기용매내에 용해가능한 효소를 반응에 사용할 수 있게 된다.  이와 같이 효소가 유기용매내에 용해된 상태로 효소 활성을 나타내는 경우에는 수분의 양이 증가함에 따라 효소의 응집에 의한 반응속도가 감소되는 효과를 제거할 수 있게 된다.  본 연구에서는 이로부터 유기용매 내에서의 효소의 응집에 의한 세부적인 연구를 진행하게 되며, 실험으로부터 얻은 결과를 토대로 유기용매내 효소반응의 시스템 해석을 하고자 한다.

실  험

유기용매 내에서의 효소반응을 분석하기 위한 반응 시스템은 용매를 사이클로 헥산으로 하는 옥타노익산의 메틸에스터(octanoic acid methyl ester)를 합성하는 에스터화 반응이다.  촉매 활성을 갖는 효소로는 리파제(Lipase from Candida rugosa, Meito Sangyo)를 사용하였고, 모든 반응은 온도 30oC, 교반속도 100rpm에서 수행하였다.  반응 시스템의 총 부피는 15ml로 하였으며, 첨가되는 효소의 양은 단백질의 양을 기준으로 18mg (Lipase OF 내의 단백질의 양은 12% w/w이다)이며, 기질의 농도는 각각 300mM로 하였다.  반응혼합물에 첨가되는 수분의 양은 0에서부터 2상계(two phase system)가 될 때까지 변화시켰으며, 수분을 첨가한 경우, 수분이 균일하게 분산될 수 있도록  30초 동안 sonication을 하였다.

반응에 사용된 효소는 지질로 코팅된 리파제(Lipase OF)로서, 지질 코팅 리파제(lipid-coated lipase)의 준비 과정은 다음과 같다.  리파제의 버퍼 수용액(lipsae 50mg in 25ml, 0.01M phosphate buffer)과 지질의 버퍼 분산액(lipid 50mg in 25ml, 0.01M phosphate buffer)을 섞은 후 4oC에서 20시간동안 교반하며 incubation 시킨다.  효소에 지질이 코팅되면 수용액에는 녹지 않으므로, 이를 침전시켜 냉동건조하면 지질이 코팅된 효소를 얻을 수 있다.  코팅에 이용되는 지질은 hydrophilic head group과 hydrophobic tail group을 갖는 amphiphilic lipid이며, hydrophilic head group의 이온화 상태에 따라 cationic, anionic, zwitter ionic, nonionic으로 나누어지며, 각각 다른 성질을 갖는 코팅물질이 된다.(Table 1)  이렇게 얻어진 지질 코팅 리파제내의 단백질의 양은 코팅 과정을 수행하기 전 후의 용액내의 단백질 분석(Lowry method)을 함으로써 결정되어지며, 코팅된 단백질의 양을 기준으로 반응에 첨가하는 지질코팅 리파제의 양을 결정하였다.

<Table 1> 친수성 부분에 따른 지질의 종류

지질종류	코팅에 사용한 지질

양이온(cationic)	Didodecylmethylammonium bromide

음이온(anionic)	Dihexadecyl phosphate

양성이온(zwittter ionic)	Phosphatidylcholine,dipalmitoyl

이온화되지 않음(nonionic)	Didodecyl N-D-glucono-L-glutamate

반응물의 분석은 HPLC(Pharmacia, column:□-Bondapak C18)로 UV 225nm 에서 분석하였다.  이 때 사용한 이동상의 조성은 acetonitrile 과 물을 8:2로 하였으며, phosphoric acid로 pH를 조절하였다.

결과 및 토론

본 연구는 친수성인 효소의 표면에 사슬이 긴 지방산을 포함한 지질을 코팅시킴으로써 효소를 반응매질에 용해시켜 mass transfer를 향상시켜, 유기용매 내에서의 효소반응 속도를 개선시키는 것을 목표로 한다.

코팅물질로 사용된 지질은 hydrophilic head group과 소수성인 긴 사슬의 지방산을 가지고 있는 amphiphile로서, 그 종류는 table 1에 제시되었다. hydrophilic head group에 양이온을 포함하는 Didodecyldimethylammonium bromide를 코팅물질로 하여 실험을 수행했을 때 얻어지는 지질코팅 리파제 (Lipid-coated lipase)는 옅은 노란색의 파우더이며, 회수율은 효소와 지질 전체에 대한 무게비로 환산했을 때 51.7%이고, 지질코팅 리파제내의 단백질의 양은 무게비로 11.7%이다.  이를 바탕으로 에스터화 반응에 사용되는 효소내 단백질 양이 18mg 이 되도록 조절한다.

얻어진 지질코팅 리파제는 반응매질인 사이클로 헥산에 용해가능하며, 이를 이용하여 위의 에스터화 반응을 수행하였을 때 그 초기반응속도는 156mM/hr/mg enzyme로 나타났다.  양이온을 가지는 코팅물질을 사용하는 경우, 음이온를 포함하는 효소의 표면과 전하차이가 크기 때문에 결합력이 커지게 되어, 코팅된 리파제의 수율이 높아지지만, 그와 동시에 활성이 많이 저하되는 것을 볼 수 있었다.  반면 음이온을 가지는 코팅물질이나 양성이온(zwitter ion)을 가지는 코팅물질을 이용해 코팅과정을 수행할 경우에는, 효소의 표면이 가지는 음전하의 영향으로 지질코팅 리파제의 수율이 매우 낮게 나타났다.  그러므로 친수성 부분에 전하를 띠지 않는(nonionic) 코팅물질을 화학적으로 합성하여 사용할 필요가 있다고 여겨진다13.

이와 같은 과정을 거쳐 얻어진 지질코팅 리파제를 사용하여 유기용매내에서 에스터화 반응을 시켰을 경우 수분의 양에 따른 반응속도를 살펴보면 다음과 같다.  코팅되지 않은 효소를 반응에 사용한 경우, 반응속도를 최대로 하는 최적 수분량은 전체 부피의 0.67%이며 수분의 양이 이보다 증가하면 반응속도가 감소하게 된다.  반면 지질코팅 리파제를 사용하는 경우 같은 효소의 양을 기준으로 했을 때 반응시스템에 존재하는 수분의 양이 전체 부피의 2%로 기존의 최적수분량보다 높을 때에도 반응속도가 증가하는 것을 알 수 있었다.

앞으로의 실험은 지질코팅 리파제 뿐 아니라 역마이셀(reversed micellar system) 에 적용된 효소를 이용하여, 효소의 응집에 대한 연구를 진행하며, 동시에 수분의 양이 많은 유기용매 시스템에서의 에스터화 반응의 반응속도를 개선하는 데 목표를 두고 진행될 것이다.  동시에 유기용매 내에서의 효소반응 시스템의 변수들의 영향을 조사, 분석하여 비수계 효소 반응의 기본 원리를 체계화하고자 한다.

감  사

본 연구는 과학 기술처에서 시행한 목적기초연구지원 중 특정 연구 과제로 수행된 것이며 연구비를 지원해 주신 과학 기술처에 감사드립니다.

참고 문헌

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