여러 가지  antifoam이 식물세포 현탁배양에 미치는 영향

김진우, 김석우, 이상윤, 이규화, 김동일

인하대학교 공과대학 생물공학과

Effects of  Various Antifoams on Plant Cell Suspension Cultures

Jin-Woo Kim, Suk-Woo Kim, Sang-Yun Lee, Gue-Hwa Lee, Dong-Il Kim

Department of Biological Engineering, Inha University, Incheon, Korea

서론

세포배양기를 이용한 식물세포배양에 있어 foam의 형성은 필연적이다. Antifoam 첨가 없이 세포배양기를 이용해 식물세포를 배양할 때 배양 초기부터 foam 형성이 관찰된다. Aeration rate의 증가에 따라 foam 발생이 증가하며 배양 후반에 이러한 현상은 더욱 두드러진다. 발생된 foam은 세포의 wall growth, floating 등을 유발해 세포생장에 부정적인 영향을 미친다(1). Foam 발생을 억제하기 위해 foam breaker를 사용하기도 하는데 세포가 붙어 자라 meringue을 형성시켜 세포농도가 불균일하게 되고 foam억제력이 antifoam에 비해 효과적이지 못하므로 antifoam의 첨가가 필요하다.

본 연구에서는 세포배양기 운전시 첨가할 antifoam의 결정을 위해 7가지 antifoam의 foam 억제력을 비교하였으며 antifoam이 Taxus cuspidata와 Digitalis lanata 세포생장에 미치는 영향을 100-□ Erlenmeyer flask에서 조사하였다. 또한 Taxus cuspidata 유래물질인 10-deacetylbaccatin(10-DAB)생산에 미치는 antifoam의 영향을 조사하였다. 위 실험 결과를 기초로 식물세포생장에 저해작용이 없고 foam 억제력이 우수하며 유용물질생산을 증대시키는 antifoam을 선택하고자 한다.

재료 및 방법

세포 및 배지

본 실험에 사용된 Taxus cuspidata (Japanese yew)는 아주대학교 생물공학과에서 제공받았으며 생장배지로는 Schenk & Hilderbrandt (SH) 기본배지에 탄소원으로 sucrose를 20 g/□가 되도록 첨가하고 □-naphtaleneacetic acid(NAA) 5 □/□, 6-benzylaminopurine(BAP) 0.2 □/□, vitamin 농축용액을 보충하여 첨가하였다. Digitalis lanata K3OHD 현탁세포는 독일 T□bingen 대학의 Dr. Rainhard로 부터 제공받았으며 Modified Murashige & Skoog(MS) 배지에 glucose가 33 g/□가 되도록 첨가하여 배양하였다.

배양조건 및 생장측정

암소의 회전식 진탕배양기에서 120 rpm, 25℃의 조건으로 100-□ Erlenmeyer flask에서 배양했으며, 세포생장을 측정하기 위해 fresh cell weight(FCW), dry cell weight(DCW)을 측정하였다. 먼저 배양액을 Buchner 깔때기를 이용하여 Whatman No. 1 여과지로 걸러 내고 동량의 물로 2회 세척 후 진공펌프를 이용해 수분을 제거하고 세포를 계량접시에 옮겨 화학저울로 FCW을 측정하였다. FCW을 측정한 후 60℃로 고정된 dry oven에서 항량이 되도록 건조하여 DCW을 측정하였다.

10-DAB 분석

영인 HPLC system을 이용하여 분석하였다. Taxsil column(250×4.6 mm, MetaChem, USA)을 사용하였으며 전개용매 조성은 MeCN:H2O가 40:60인 isocratic 조건에서 분석하였다. 용매의 유속은 1.2 □/min으로 하였고 227nm에서 U.V. 흡광도를 측정하였다.

Foam formation 측정

실험에 사용된 7가지 antifoam을 각각 30 □의 증류수, MS, SH 배지에 농도별도 첨가한 후 500 □ mass cylinder에 넣고 1.81 vvm으로 3 분간 aeration 한 뒤 발생한 foam의 부피를 측정하였다. 이 때 최종부피를 최초 배지부피인 30 □로 나누어 그 비를 foam volume이라 정의하였다(1)

결과 및 토론

본 실험에 사용된 surfactant의 종류와 특성은 Table 1과 같다. 특히, Pluronic F-68은 동물세포배양에 많이 사용되는 non-ionic surfactant로 protective effect가 있어 세포생장을 증진시킨다고 보고된 바 있다(2,3). Antifoam과 Pluronic F-68이 T. cuspidata와 D. lanata 세포생장에 미치는 영향을 조사하기 위해 antifoam 첨가 후 10일째의 세포건조중량을 비교하였다. T. cuspidata 세포의 경우 Pluronic F-68 첨가는 세포생장에 큰 저해작용이 없었으며 Pluronic F-68 첨가량이 증가함에 비례해 FCW/DCW ratio가 감소함을 볼 수 있었다(Fig.1). Antifoam A(A.A), A compound(A.C), antifoam A emulsion(A.A.E), antifoam C emulsion(A.C.E)의 첨가는 D. lanata와 T. cuspidata 생장에 저해작용이 없었으며 antifoam 289(289)과 antifoam 204(204)은 세포생장을 크게 저해함을 볼 수 있었다(Table 2). 289와 204는 미생물배양시 널리 쓰이는 antifoam이지만 D. lanata 와 T. cuspidata 세포배양에는 적당하지 않음을 알 수 있다. 한편, Fig. 2는 Pluronic F-68과 antifoam이 D. lanata세포생장과 세포크기에 미치는 영향을 보여주는데 3종류 모두 세포생장을 저해하지 않았으며 Pluronic F-68 첨가시 세포크기가 줄어듬을 볼 수 있었다. 배양기간 중 Pluronic F-68이 세포생장에 미치는 영향을 조사하기 위해 4 g/□의 Pluronic F-68을 첨가한 후 세포생장을 6일간 관찰하였다(Fig. 3). 세포생장은 대조구와 비슷했으며 Pluronic F-68 첨가시 FCW/DCW ratio가 10-20% 감소됨을 관찰할 수 있었다.

Pluronic F-68은 실험농도에서 세포생장에 저해작용이 없어 식물세포배양시 첨가에 문제가 없고 세포크기를 감소시키는 효과가 있으므로 고농도배양에 적합한 첨가제라 할 수 있다(4). 이러한 세포크기 감소는 agitation, aeration시 받게 되는 물리적 충격을 감소시키는 요소 중의 하나가 됨으로 세포배양기에서 고농도배양시 유리하다고 하겠다. 여러 antifoam의 foam억제력을 비교하였을 때, 모든 antifoam은 효과적으로 foam 발생을 억제함을 볼 수 있었다. Table 3은 MS 배지에서 여러 antifoam의 foam 억제력을 비교한 것인데 그 중 antifoam A 계열, A compound, A.C.E의 foam 억제력이 비교적 우수하였으며 배지 내 분산되는 정도는 A.A.E., A.C.E.가 우수하였다. A.A.E. 와 A.C.E.는 세포생장을 저해하지 않으며 foam억제력이 우수하며 첨가가 용이함으로 세포배양기에 첨가가 적당하리라 예상할 수 있다. Antifoam과 Pluronic F-68 첨가가 T. cuspidata 유래 taxol의 유도체인 10-DAB 생산에 미치는 영향을 조사하기 위해 배양 10일째 10-DAB의 농도를 측정하였다. Fig. 4에서 볼 수 있는 것처럼 antifoam과 Pluronic F-68 첨가는 10-DAB의 생산을 최고 4.5배 증진시킴이 관찰되었다(Fig. 4). Pluronic F-68은 hydrophobic center (polyoxypropylene)와 hydrophilic ends(polyoxyethylene)을 가진 co-polymer로 알려져 있는데, 현탁배양시 polyoxypropylene center가 세포의 hydrophobic region과 결합해 세포벽에 hole을 형성하여 permeability을 높여 준다고 한다(5,6). 이러한 변화가 세포 외로 10-DAB의 분비를 촉진한다고 생각할 수 있겠다. 실험에 사용된 antifoam은 대부분 hydrophobic property를 가지는데, 현탁배양시 세포벽을 감싸 세포의 환경을 변화시키며 hydrophobic property를 가진 10-DAB 생산을 유도한 것이라 추측된다. 식물세포배양에 있어 Pluronic F-68의 protective effect에 대해서는 앞으로의 실험을 통해 밝혀야 될 부분이며, 위 실험에서 밝힌 결과는 세포배양기를 이용한 식물유래 유용물질생산시 생산성을 높일 수 있는 가능성을 제시해 주었다.

Table 1.  Characteristics of various kinds of surfactants

	분 류	제조 회사
Antifoam A	silicone	Sigma
Antifoam A emulsion	silicone(antifoam A 계열)	Sigma
Antifoam C emulsion	silicone(antifoam A 계열)	Sigma
A compound	silicon	Dow Corning
Antifoam 204	non-silicon	Sigma
Antifoam 289	silicon & non-silicon	Sigma
Polyethylene glycol		Aldrich
Pluronic F-68	non-ionic surfactant	Sigma

Table 2. Effects of various kinds of surfactants on plant cell culture

	Control	A.C	A.A	A.C.E	A.A.E	PPG	204	289	F-68
D. lanata	15.04 (g/□)	15.09	15.19	15.70	15.19	14.27		3.96
T. cuspidata	15.63 (g/□)	14.30	14.74	15.04	16.86	14.72	9.83	9.57	15.59

Table 3. Effects of various antifoams on foam control in MS medium

종 류	Cont	289		A.A		A.C		P.P.G		A.A.E		A.C.E		204
Antifoam Conc.(g/□)	0.00	0.80	3.98	0.80	3.77	0.81	3.67	0.96	3.67	0.83	3.96	0.93	4.20	0.91	3.68
Foam Vol.	8.38	2.82	2.14	1.68	1.79	1.59	2.16	2.56	2.44	1.62	1.24	1.32	1.03	2.19	2.47

참고 문헌

Wongsamuth, R. and Doran, P. M.: Biotechnol. Bioeng., 44, 481(1994).

King, A. T., Davey, M. R., Milligan, B. J. and Lowe, K. C.: Biotechnol. Lett.,

12, 29(1990).

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Technol., 13, 148(1991).

Su, W. W. and Humphrey, A. E.: Biotechnology. Lett., 12, 793(1990).

King, A. T., Lowe, K. C. and Mulligan, B. J.: Biotechnol. Lett., 10, 177(1988).

Murhammer, D. W. and Goochee, C. F.: Bio/technology, 6, 1411(1988).