Reverse Micelle을 이용한 단백질 추출에서 상간이동법과 분자체를

이용한 탈수법의 비교

문창섭, 노경호, 정성택

인하대학교, 화학공학과

Comparison of Phase Transfer Method and Dehydration Method with Molecular Sieves in Protein Extraction by Reverse Micelles

Chang Sup Mun, Kyung Ho Row, Sung Taik Chung

Dept. of Chem. Eng., Inha University

서론

Reverse micelle을 이용한 단백질 추출법은 생물학적 활성을 유지시키면서 빠른 시간내에 선택적인 추출을 해낼 수 있는 장점을 가지고 있다.  따라서 지난 10여년동안 여러 단백질의 추출에 대해 주요 변수로서 pH, 이온 세기가 미치는 영향에 대한 많은 연구가 진행 되었다.[1,2,3]

이러한 추출공정은 먼저, 선택적으로 단백질을 reverse micellar phase로 이동시키는 forward transfer와 reverse micelle core 안의 단백질을 다시 aqueous phase로 회수해내는 backward transfer의 두 단계로 나눌 수 있다.  이러한 단백질의 이동 은 주로 두 상의 접촉에의한 phase transfer method에 의해 이루어진다.

Phase transfer method외에 backward transfer 공정에서 silica gel을 reverse micellar phase에 투입하여 reverse micellar core 속의 물, 계면활성제, 그리고 단백질을 silica gel에 흡착시켜 단백질을 회수해내는 공정이 발표되었다.[4]  그러나 다량의 계면활성제가 단백질과 함께 흡착되는 단점 때문에 최근에는 4Å의 세공 크기를 갖는 Na-A형 분자체를 사용하여 계면활성제는 거의 흡착시키지 않으면서 reverse micellar core 속의 물만을 흡착시켜 단백질을 침전으로 얻는 방법이 보고 되었다.[5]

본 연구는 음이온성 계면활성제인 AOT (Sodium di(2-ethyl-hexyl) sulfo -succinate)와 isooctane으로 이루어진 reverse micellar phase를 이용하여 단백질 분해 효소인 □-chymotrypsin을 phase transfer method에의해 forward transfer시킨 후,  backward transfer시에 phase transfer method와 분자체를 이용하여 단백질을 얻어내는 방법에 대해 forward transfer 조건에 따른 각각의 backward transfer efficiency를  비교하였다.

실험

본 실험에 사용된 단백질인 □-chymotrypsin (from bovine pancreas)과 음이온성 계면활성제인 AOT(Sodium di(2-ethylhexyl)sulfosuccinate)는  Sigma에서 구입하였고,  iso-octane (2,2,4-trimethylpentane)은 Aldrich에서 구입한 시약을 사용하였다. Na-A형 분자체는 Merck에서 구입한 시약을 사용하였다.  모든 단백질의 phase transfer 실험은 50ml 용량의 마개가 있는 삼각 플라스크와 water jacket을 이용하여 24℃에서 진행하였다.

Forward transfer의 경우 reverse micellar phase는 50mM AOT/isooctane이고, aqueous phase의 pH와 이온세기는 20mM acetate buffer와 NaCl로 조절하였고, 초기 □-chymotrypsin의 농도는 1mg/ml이다.  이 두 상을 각각 15ml씩 제조하여 삼각 플라스크에서 400rpm으로 magnetic stirring에 의해 두 상을 접촉시키면서 정해진 시간 간격에 따라 1ml씩 채취한다.  원심분리된 각 상의 단백질의 농도는  280nm에서 UV-Vis spectrophotometer(Varian, Australia)를 이용하여 측정하였다.  이때 □-chymotrypsin의 extinction coefficient는 50,000M-1cm-1를 사용하였다.

Backward transfer는 forward transfer후에 1시간 정도 상압에서 상분리를 일으킨후, 단백질이 이동한 reverse micellar phase 12ml와 다시 단백질이 이동할 20mM phosphate와 KCl로 이루어진 용액 12ml을 약 700rpm에서 30분간 교반하면서 같은 방법으로 일정시간 간격에 따른 단백질의 농도 변화를 측정하였다.

각 조건에 따른 forward와 backward transfer시의 reverse micellar phase의 물의 증가량은 coulomatic Karl-Fisher titrator와 titration controller(Accumat model 150, Fisher Science, USA)을 이용하여 Karl-Fisher titration에 의해 측정하였다.

분차체를 사용한 backward transfer는 phase transfer method에서와 같이 forward transfer후에 reverse micellar phase에 분차체를 투입하여 상온에서 약 20분간 혼합후 침강시켰다.  분차체의 투입량에 따른 단백질의 이동효율은 reverse micellar phase에 남은 단백질의 양을 측정함으로써 구하였고, Karl-Fisher titration에 의해 분자체에 흡착되고 남은 물의 양을 측정하였다.

Table 1. Experimental variables.

	Variables	Forward Transfer	Backward Transfer
Phase Transfer	pH	20mM Acetate pH 5, 6, 7, 8	20mM Phosphate pH 6, 7.5, 9, 10.5, 12
	Ionic Strength	NaCl 0.2, 0.3, 0.4, 1.0M	KCl 0.2, 0.3, 0.4, 1.0M
	rpm	350, 400	750
Using Molecular Sieves	Molecular Sieves Input		After Forward Transfer 50, 100, 150, 200mg/ml

결과 및 고찰

Fig. 1은 Forward transfer의 경우 0.2M NaCl의 일정한 농도에서 acetate buffer의 pH 변화에 따른 aqueous phase에서의 □-chymotrypsin의 농도 변화이다.  aqueous phase의 pH가 5에서 부터 점점 증가하여 □-chymotrypsin의 pI값인 8.1에 가까워 짐에 따라서 □-chymotrypsin 표면의 전하 밀도가 낮아지기 때문에 reverse micelles과의 정전기적 인력이 약해지게 된다.  따라서 pH가 높아질수록 □-chymotrypsin이 이중피막으로 이루어진 계면을 통과하여 reverse micellar phase로 이동되는 효율과 속도가 줄어들게 되지만, 효율의 경우 그 정도가 그리 크지는 않다.

Fig. 2는 각각의 forward pH 조건에서 단백질을 reverse micellar phase로 이동시킨 후, pH 7.5 phosphate buffer, 1M KCl의 일정 조건에서 backward transfer를 실시한 결과이다.  Forward transfer 조건중 pH5인 경우가 pH6, 7인 경우보다 월등히 backward transfer의 효율이 우수하였다.  이는 □-chymotrypsin을 phase transfer method에 의해 추출하는 경우 forward pH 조건에 따른 forward transfer의 효율은 크게 다르지 않지만 그 조건이 backward transfer의 효율과 속도에 미치는 영향은 매우 크게 나타남을 보여 준다.

Fig. 3, 4는 분자체를 사용하여 backward transfer를 실행한 결과이다.  Fig. 3에서 forward transfer후의 reverse micellar phase의 물의 양(0 mg/ml인 조건)은 forward pH 조건이 증가함에 따라 단백질의 이동량이 줄어들고, 그 대신 물의 이동량이 조금씩 증가 하였다.  그리고, 분자체의 투입량이 증가함에 따라 흡착되고 남은 reverse micellar phase 속의 물의 양이 줄어들고 200mg/ml로 분자체를 투입한 경우에는 물이 거의 존재하지 않는다.  또한 각각의 forward pH에 따라 같은 비율로 물의 양이 줄어들고 있어 forward pH 조건에 크게 영향을 받지 않는 것으로 나타난다.

Fig. 4는 분자체를 사용할 경우, 분자체의 투입량이 증가 함에 따라 단백질의 backward transfer 효율이 약 90%까지 증가하고, pH6, 7과 같은 다른 조건에서도 각각 80.27, 69.01%로 크게 향상됨을 보여 준다.

Fig. 5는 앞의 두가지 방법에 대하여, forward pH 조건에 따른 backward transfer 효율을 나타낸 것이다.  phase transfer method로는 pH6, 7에서 backward transfer 효율이 약 20%이하정도로 나타났으나, 분자체를 사용할 경우 여러 조건에 대해 70-90%의 높은 효율을 얻을 수 있었다.  이는 단백질 추출시 backward transfer에서 분자체를 이용하면 forward transfer의 경우 심한 pH 조작을 하지 않고도 다량의 단백질을 얻어 낼 수 있는 장점이 있다.

참고 문헌

1. Rahaman, R. S., chee, J. Y., Cabral, M. S., and Hatton, T. A., Biotech. Prog.,  4, 4, 218 (1988)

2. Dungan, S. R., Bausch, T., Hatton, T. A., Plucinski, P., and Nitsch, W., J.      Colloid Interface Sci., 145, 33 (1991)

3. Lye, G. J., Asenjo, J. A., and Pyle, D. L., chem. Eng. Sci., 49, 3195 (1994)

4. Maecozzi, G., Correa, N., Luisi, P. L., and Caselli, M., Biotechnol. Bioengng.,    38, 1239 (1991)

5. Gupta, R. B., Han, C. J., and Jhonston, K. P., Biotechnol. Bioengng., 44, 830 (1994)