액체 크로마토그래피에서 관의 효율을 나타내는 회귀분석 방법

최두찬, 정성택, 노경호

인하대학교 화학공학과

Regression Analysis of Column Efficiency in Liquid Chromatography

Du Chan Choi, Sung Taik Chung,  Kyung Ho Row

Dept. of Chem. Eng., Inha University

서론

고성능 액체 크로마토그래피 (high performance liquid chromatography)에서 관의 효율은 일반적으로 HETP (height equivalent to a theoretical plate)로 표현되고 있다. HETP는 Knox에 의해서 최초로 이동상의 유속과 관련지어졌고 관의 효율을 최적화하기 위한 접근 방법으로서 HETP에 영향을 주는 이동상의 유속, 이동상의 조성 및 관의 온도등을 연구하였다[1].

제조용 액체 크로마토그래피 (preparative liquid chromatography)에서는 시료의 양과 크기 및 충진물의 직경이 증가하기 때문에 시료의 확산, 분산 및 관내에서 시료간의 상호작용등이 일어난다. 이로 인하여 흡착등온선이 비선형의 형태로 나타나고 분리효율이 감소하게 된다. 따라서 PLC에서 효율적인 분리를 하기 위해서는 여러 가지 조업 변수들을 조합하여 최적의 분리 조건을 구하는 것이 중요하다. 이를 위해서 크로마토그래피의 peak에 관한 연구가 주목받기 시작하였다. Gidding을 효시로 하여 다양한 모델들이 제시되었다[2]. Barber는 tailing이 일어난 peak로부터 이론단수(N, number of theoretical plate)를 계산하는 기하학적인 방법을 개발하였다[3]. Guinchon 등은 확산계수의 압력의존성과 확산계수가 단높이에 미치는 영향에 대하여 연구하였으며 고농도의 시료가 주입된 LC에 대한 컴퓨터 모사를 하였다[4]. 최근에는 Berthold가 Gaussian 함수를 변형한 EMG (exponen- tially modified Gaussian)함수까지 수학적 모델을 확장하였다[5]. Wu와 Gu는 분리되지 않은 peak pair에 대하여 비대칭인자를 고려하여 정확한 peak 면적을 구하여 정량분석을 하였고 다변수 선형회귀법과 EMG함수를 사용하여 peak 높이의 비율에 따른 이론단수 계산식을 개발하였다[6]. Gai와 Wu는 크로마토그래피상에서의 통계적 적률(積率)의 계산과 비회선형에 대한 접근을 시도하였다[7]. 특히  Guillaume과 Guinchard는 관의 온도등을 실험 변수로 하여 에스테르계 물질을 분리하는 방법을 제시하여 HETP의 온도의존성을 보고하였다[8].

본 연구에서는 시료의 주입부피와 시료의 농도, 이동상의 유속 및 이동상의 조성 변화가 HETP에 미치는 영향을 고찰하였다. 지수 2차승 선형회귀법에 의하여 각각의 실험변수가 HETP에 미치는 영향을 회귀분석식으로 나타내었다. 2개의 실험변수를 고정하였을때 다른 2개의 독립변수가 HETP에 미치는 영향은 3차원 그래프에 의하여 나타내었다.

실험

본 실험에 사용된 system은 HPLC metering pump(Model 2396-26, TSP)와 U6K injector (2ml sample loop), 6000psi까지 압력을 조정할 수 있는 back pressure regulator (Tescom co., Model 26-1722), rotameter 등으로 구성되어 있다. 시료의 검출은 254nm의 파장에서 UV variable detector를 PC에 on-line으로 연결하였다. Column은 pore size 120Å, particle size 40∼63□인 octadelcyl silica (YMC co.)로 충진되었으며 크기는 250mm×7.8nm I.D., 500×7.8mm I.D.이다.

실험에 사용한 시료인 thymidine은 Sigma Co.에서 구입하였으며 HPLC- grade의 물에 용해하여 각각 500∼10,000ppm의 용액을 만들어 사용하였다. 이동상은 물을 사용하였고 organic modifier는 메탄올이었으며 이동상의 유속은 3.5∼5.5□/min이었다. 물은 실험실에서 제조한 증류수이며 탈이온화 한후 mebrane filter로 여과하였으며 methanol은 Baker co.(Phillipsburg NJ, USA)에서 구입한 HPLC용매이고 여과하여 사용하였다. 모든 실험은 상온에서 행하였으며 각 실험변수의 범위는 Table 1에 나타내었다.

Table  Experimental variables and ranges

Variables	Range
injection volume	0.1-2.0 □
concentration	0.5-10 □/□
sample amount	0.1-20 □
flow rate	3.5-5.5 □/min
methanol percentage	1-20 (v/v, %)

결과 및 고찰

이론단수(N, number of theoretical plate)는 일정한 충진물이 있는 관과 특정한 시료에 대해서 peak의 폭과 체류시간의 관계로부터 얻어진다. 관 효율로서 표시되는 N은 peak의 높이에 따라 계수가 달라진다. 본 실험에서는 다음식에 의해서 N값을 구하였다.

[eqn: rm N~`=~`&5.54·(`t sub R OVER W SUB h/2`)^2~~~~~~~~~~~~~~`(1) ## rm t sub R~ &:~ retention ~time ## rm W SUB h/2 ~&:~peak~ width~ at ~half~ height]

역상 액체 크로마토그래피에서 HETP는 관내의 충진물과 시료에 대한 관의 효율을 나타낸다. HETP는 이동상의 유속, 이동상의 조성, 관의 온도, 시료의 주입량 및 관의 크기와 같은 실험변수에 의해 주로 영향을 받는다. HETP는 관의 길이 L을 이론단수 N으로 나누어 구하였다.

실험에서 구한 chromatogram으로부터 구한 HETP와 4개의 실험변수의 관계를 나타내기 위해서 (1) linear equation, (2) quadratic equation, (3) quadratic equation with interaction terms (x1x2, x1x3, x1x4...)과 위 3식에 대한 자연로그 형태등 총 6개의 식으로 상관하였다. 그중에서 가장 regression coefficient가 좋은  다음과 같은 quadratic equation with interaction term based on natural logarithm을 사용하였다.[eqn: HETP`=`&0.16-0.14Lnx sub 1+0.05Lnx sup 2 -0.27Lnx sub 2 +0.12Lnx sub 1 Lnx sub 2 ## +&0.1Lnx sub 2 sup 2 + 0.09Lnx sub 3 + 0.07Ln x sub 1 x sub 3 +0.07Ln x sub 2 x sub 3 - 0.07 Ln x sub 3 sup 2 ## +&0.14 Ln x sub 4 +0.08Ln x sub 1 x sub 4 + 0.17Ln x sub 2 x sub 4 + 0.31Ln x sub 3 x sub 4 - 0.09Ln x sub 4 sup 2]

여기서 x1, x2, x3, x4는 각각 시료의 주입부피와 시료의 농도, 이동상의 유속 및 이동상내에서의 메탄올 퍼센트를 나타낸다. 4가지 실험변수에 대하여 2가지 실험변수를 고정하였을때 다른 2가지의 실험변수가 HETP에 나타내는 영향은 Fig. 1, Fig. 2, Fig. 3에 나타내었다.

참고문헌

1. J. H. Knox, J. Chrom. Sci., 15, 352 (1977).

2. J. C. Giddings, Dynamics of Chromatography, Part Ⅰ, M. Dekker, New York,      NY, 1965.

3. W. E. Barber and P. W. Carr, Anal. Chem., 55, 1939 (1981).

4. G. Guinchon, S. Golshan-Shirazi, and A. Jaulmes, Anal. Chem., 60, 1856	(1988).

5. A. Berthold, Anal. Chem., 63, 1879 (1991).

6. N. S. Wu and G. H. Gu, Chromatographia, 32, 373 (1991).

7. C. P. Cai and N. S. Wu, Chromatographia, 31, 593 (1991).

8. Y. Guillaume and C. Guinchard, J. Chrom. Sci., 33, 204 (1995).

Fig.1 Three Dimensional Plots of HETP vs. Injection Volume and MeOH Percentage (1mg/ml, 3.5ml/min, 9.8mm□250mm)

Fig. 2 Three DImensional Plots of HETP vs. Injection Volume and Flow Rate. (1mg/ml, 5% MeOH, 7.8 □ 500mm)

Fig. 3 Three Dimensional Plots of HETP vs. Flow Rate and MeOH Percentage. (1mg/min, 1ml Injection, 7.8 □ 500mm)